| 研究課題/領域番号 |
04660097
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| 研究機関 | 福山大学 |
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研究代表者 |
廣海 啓太郎 福山大学, 工学部, 教授 (50025425)
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| 研究分担者 |
室岡 義勝 広島大学, 工学部, 教授 (60029882)
岩本 博行 福山大学, 工学部, 助手 (90213321)
廣瀬 順造 福山大学, 工学部, 助教授 (70080215)
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| キーワード | プルラナーゼ / シクロデキストリン / 活性部位構造 / マルトオリゴ糖 / オリゴ糖アリコール / 酵素反応速度論 / 変異酵素 |
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| 研究概要 |
1) Klebsiella pneumoniae由来のプルラナーゼの結晶標品につき、α-、β-、γ-シクロデキストリンとの相互作用を、プルランを基質とする酵素反応の阻害、ならびに紫外部吸収差スペクトル、蛍光スペクトルの変化を指標として詳細に研究した。3種のシクロデキストリン(CDと略す)はいずれも拮抗型の阻害を示し、その阻害物質定数Kiは蛍光滴定から求められた酵素-シクロデキストリン複合体の解離定数Kdと一致した。中でもβ-CDは最も結合が強く、α-、γ-CDに比べて親和力が約2.5kcal/molも大きい。また紫外部の吸収差スペクトルもβ-CDだけが微妙に異っており、カロリメトリーから得られた結合の標準エントロピー変化DS°もβ-CDのみが正の値を示すなど、β-CDは酵素に対して特徴的な結合様式をとることが知られた。
2) 同酵素と重合度を異にするマルトオリゴ糖及び対応する糖アルコール類との相互作用を、同様に阻害及び蛍光スペクトル変化について調べた。上記のCDの場合と異なり、KiとKdは一致せず、基質の結合を妨げる部位と、トリプトファン残基の微環境変化による蛍光変化を生じる部位の2種類があることが示唆された。
3) β-CDにトシル基、ダンシル基を導入した誘導体につき、阻害物質定数を検討した結果、酵素の活性部位に存在する疎水性側鎖がβ-CDの環内に貫入することにより、酵素との結合を強めている可能性を示唆する実験結果が得られた。
4) Klebsiella aerogenesのプルラナーゼにつき、数種の変異酵素を作成した。その中のあるものは、野性型酵素よりも高温で活性を保持していた。また部位特異的変異により、全く活性を失った変異酵素も得られた。
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