|
[2-^3H]マンノースを用いたトリチウム自殺法による選択的濃縮を経てマウス乳癌由来FM3A細胞から分離されたG258株は、単一変異でリピド中間体生合成に関して温度感受性(低温では正常にGlc_3MaN_9-GlcNAc_2-P-P-Dolまで生合成されるが、高温ではMan_3GlcNAc_2-P-P-Dol付近で生合成停止)を示し、かつ、細胞増殖に関して温度感受性を示す。すなわち、G258株においては、高温ではリピド中間体生合成が異常であるために増殖できない。このことから、G258株の細胞増殖に関する温度感受性からの回復を指標に、G258株のリピド中間体生合成変異に相補的なcDNAの分離が可能になった。昨年度は、pcD2ベクターに組み込まれたヒト肝臓cDNAライブラリーを電気穿孔法でG258株に移入し、高温で増殖できるようになった第一次形質転換候補株の分離を試みた。得られた候補株から、そのcDNAクローンを、アンピシリン耐性マーカーを指標に、大腸菌DH-1株に回収した。しかし、得られた一例は、pcD2ベクターそのものであることが、制限酵素による消化断片のアガロース電気泳動による泳動パターンから判明した。G258株のリピド中間体生合成変異に関する自然復帰変異株にpcD2ベクターそのものが移入されたことが考えられる。ところで、G258株は、親株のFM3A細胞と同様に球状の浮遊細胞であるので、DNAの移入効率が非常に悪い。そこで、今年度は、新たに、DOTAPを用いたリポフェクション法を試み、従来のDNA-リン酸カルシウムゲル共沈法、および、電気穿孔法と比較した。DNA移入効率はジェネティシン耐性マーカーの移入頻度で測定した。その結果、リポフェクション法は電気穿孔法と同程度のDNA移入効率を示し、DNA-リン酸カルシウムゲル共沈法は、それらの場合より10倍効率が低かった。このような現状から、引続き、電気穿孔法を用いて、G258株の第一次形質転換候補株の集積と解析を行っている。
|
