蛋白質分泌生産系を用いた抗体可変領域構造の安定化に関する研究

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04660112
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 山形 秀夫 名古屋大学, 農学部, 助教授 (20023468)
• キーワード: 蛋白質分泌生産系 / Bacillus brevis / 抗体可変領域構造 / α8 / β8バーレル構造 / 安定化 / 融合蛋白質

研究概要

マウス・ヒトキメラ抗ヒトウロキナーゼ抗体H鎖およびL鎖cDNA(武田薬品工業より分与)の可変領域をコードする部分(VH-およびVL-DNA)をPCR法により増幅した。増幅したDNAをBacillus licheni-formisのα-アミラーゼ遺伝子の中のα8/β8バーレル構造上部または下部に存在するループをコードする部分にそれぞれ挿入した。VH-DNAを挿入した遺伝子とVL-DNAを挿入した遺伝子との間の組み換えにより融合遺伝子を作製し、Bacillus brevis47に導入した。このようにして得られるB.brevisの形質転換株の中から抗原結合能を持つ融合蛋白質を生産するクローンを検索したが、現在のところ目的のクローンは得られていない。本研究目的達成のためには、B.brevisを宿主としたヒトおよび動物蛋白質の分泌生産の効率を一層改善する方法の開発が必要であると考えられた。そこでヒトインターロイキン2、ヒト上皮細胞増殖因子遺伝子を用いて、分泌ベクターのシグナルペプチドに種々の改変を行い、また複製領域としてB.brevis由来プラスミドの複製領域を利用することを試みた。この結果ヒトインターロイキンについては従来の系の約50倍、ヒト上皮細胞増殖因子については約5倍に達する生産効率改善に成功した。また異種蛋白質の分解に主要な役割を果している大腸菌lon遺伝子と相同的なB.brevis遺伝子及び菌体外蛋白質の分解を阻害しているB.brevisのプロテアーゼインヒビター遺伝子を単離し、その役割について解析した。現在これらの研究で得られた知見を応用し、上記の融合蛋白質を効率よく生産するクローンの分離を行いつつある。

研究成果

• [文献書誌] Shogo Ebisu: "Production of human epidermal growth factor by Bacillus brevis increased with use of a stable plasmid from B,brevis 481." Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 56. 812-813 (1992)
• [文献書誌] Kimio Ito: "Cloning,characterization,and inactivation of the Bacillus brevis lon gene." Journal.of Bacteriology. 174. 2281-2287 (1992)
• [文献書誌] Yasuhiro Shiga: "Characterization of an extracellular protease inhibitor of Bacillus brevis HPD31 and nucleotide sequence of the corresponding gene." Applied and Environmental Microbiology. 58. 525-531 (1992)
• [文献書誌] Shigezo Udaka: "High level expression of heterologous proteins by Bacillus brevis." Methods in Enzymology. 217. 23-33 (1993)
• [文献書誌] 山形 秀夫: "Bacillus brevisによる蛋白質の分泌" 蛋白質核酸酵素(臨時増刊). 37. 258-268 (1992)