| 研究概要 |
メチロトローフ細菌のC_1化合物固定経路であるリブロースモノリン酸経路では,ホルムアルデヒドとリブロース5-リン酸とのアルドール縮合を触媒するヘキシュロースリン酸シンターゼが関与する.この酵素反応では,ホルムアルデヒドの炭素はヘキシュロース6-リン酸のC-1位に取り込まれ,これが異性化されてフルクトース5-リン酸,さらにグルコース5-リン酸となる.この場合,^<13>C-ホルムアルデヒドを反応に用いると,C-1位が^<13>Cでラベルされた6炭糖リン酸を合成することができる.本研究では,この増炭反応を利用して臨床検査に有用な^<13>C-フルクトースおよびグルコースを合成しようとするものである.
1.安定なヘキシュロースリン酸シンターゼ生産菌の選別:高温性のメチロトーフであるBacillus sp.おメチルアミン類資化性菌などを対象にスクリーニングし,ジメチルアミンに生育したMycobacterium sp.が最も高い酵素活性を有し,しかも無細胞抽出液中にホルムアルデヒトを残存しないことを見いだし,これを最優良株として選定した.
2.酵素遺伝子のクローニング:Mycobacterium sp.およびMethylomonas aminofaciens 77aを遺伝子源とし,各細菌のヘキシュロースリン酸シンターゼのN-未端アミノ酸配列より作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて,クローニングを行った.大腸菌内での活性の発現は認められなかったが,サザンハイブリダイゼイションで陽性のクローンについて現在塩基配列の決定を行っている.
3.バイオリアクターの構築:メチルアンミンに生育したMycobacterium sp.の無細胞抽出液を酵素源として,^<13>C-ホルムアルデヒドとリボース5-リン酸との反応より,^<13>C-フルクトース5-リン酸および^<13>C-グルコース6-リン酸をそれぞれ高濃度,高収率で合成する反応系を構築した.
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