| 研究課題/領域番号 |
04660126
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
百瀬 春生 東京理科大学, 基礎工学部, 教授 (30219993)
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| 研究分担者 |
田口 精一 東京理科大学, 基礎工学部, 助手 (70216828)
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| キーワード | 低温適応 / プロテアーゼ / 活性上昇 / 限定域突然変異 / ランダム突然変異 / 遺伝子工学 / 進化工学 / タンパク質工学 |
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| 研究概要 |
前年(平成5年)度には、すでにランダム突然変異の導入により、活性低下1次変異から活性復帰2次変異を得るという原理を基盤としたスクリーニング系を駆使して、活性向上型サチライシンの分離に成功している。今年度は、さらに本システムを改良し、低温域でさらに活性向上した、あるいは異なったタイプの低温適応を示すサチライシンの創成を試みた。まず従来どうり、活性復帰2次変異においてサチライシン活性の指標となるクリアゾーンの形成を10℃で行うことで、低温に適応した変異酵素の分離を実行した。スクリーニングの結果、得られた変異体は10℃において野生型の30%以下の活性向上にとどまっていた。そこで、変異の可能性を広げるために、活性低下1次変異体の母集団を増大させ、既知の高活性変異体の示す活性を指標に効率的な高活性サチライシン・アッセイシステムを構築した。その結果、野生型と比べ低温に特異的に活性上昇を示す新しいタイプの変異体が分離された(M-15)。さらに、10℃において野生型との相対活性が50%以上向上した変異体(m-51)が容易に分離できるようになった。そこで、M-15およびm-51の精製標品について詳細な酵素学的解析を行った。
M-15の低温域における相対活性を測定した結果、低温にシフト(25℃から1℃に向けて)するほど相対活性が向上していた。動力学パラメーターの測定から、この相対活性向上はとくに基質の結合性を示すKm値に反映されていることが判明した。また、高温処理後の活性低下率は野生型と変わらないこと、10℃におけるCD測定の結果から、2次構造に影響を与えるような大きなコンフォーメーション変化はないことが分かった。m-51は、10℃-25℃の範囲で、野生型と比べ約70%の活性向上を示した。この活性上昇は、Km値k_<cat>値の両方の寄与によることが明らかとなった。
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