| 研究課題/領域番号 |
04670150
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 輝捷 札幌医科大学, 附属癌研究所, 教授 (00045494)
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| 研究分担者 |
山下 由美 札幌医科大学, 附属癌研究所, 技師
石埜 正穂 札幌医科大学, 附属癌研究所, 助手 (30232325)
佐々木 洋子 札幌医科大学, 附属癌研究所, 講師 (60045424)
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| キーワード | タンパク質チロシンキナーゼ / cDNA発現クローニング / T細胞受容体 / CD3複合体 / B細胞抗原受容体 / バキュロウィルス発現系 |
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| 研究概要 |
1.T細胞受容体(TCR)/CD3複合体ζ鎖およびB細胞抗原受容体Ig-α鎖のリン酸化チロシン領域を認識・結合するシグナル伝達タンパク質のクローン化。(1)^<32>P-標識ζ鎖およびIg-α鎖ペプチドプローベの調製。ζ鎖およびIg-α鎖のD/EX_2YX_2LX_7YX_2L/Iモチーフを含むペプチドを合成し、Srcファミリー・タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)であるLckを用いてin vitroで^<32>P標識した。Lckはマウスlck cDNAをバキュロウイルス発現系によりSF9細胞で発現し、これをSepharoseに固相化した抗Lck抗体を用いて集め、このLck・抗体複合体に上記ペプチドを加え、[γ-^<32>P]ATPにより高比活性に標識した。^<32>P-標識ペプチドはHPLCにより精製した。(2)ヒトT細胞白血病株Jurkatおよびヒト脾臓のcDNAライブラリーをそれぞれ^<32>P-標識ζ鎖あるいは^<32>P-標識Ig-α鎖ペプチドプローベでスクリーニングし、それぞれ数個のクローンを得た。得られたクローンをBluescriptベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定した結果、未知のタンパク質をコードするcDNAであることを確認した。 2.TCR/CD3複合体ζ鎖とSrcファミリーPTK、Fyn、との会合。ζ鎖とFynおよびLckをバキュロウイルス発現系を用いてSF9細胞で発現し、ζ鎖とFynおよびLckとの直接結合の可能性を検討した。FynやLckのSF9細胞における発現に伴い、これらのPTKの自己リン酸化とSF9細胞内タンパク質のリン酸化昂進が見られ、産生PTKの少なくとも一部が活性型になっていることが示された。FynまたはLckとζ鎖との同時発現を行ったところ、ζ鎖のリン酸化とそれに伴うSDS-PAGE上での電気泳動移動度の変化が観察された。Fynはチロシン残基リン酸化ζ鎖にそのSH2領域で会合した。この会合はLckではFynに比べ弱い。炭酸ガスインキュベーターは、Sf9細胞の培養に使用した。
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