| 研究課題/領域番号 |
04670150
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 輝捷 札幌医科大学, 医学部・付属がん研究所, 教授 (00045494)
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| 研究分担者 |
名倉 和子 札幌医科大学, 付属がん研究所, 研究技師
佐々木 洋子 札幌医科大学, 付属がん研究所, 講師 (60045424)
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| キーワード | タンパク質チロシンキナーゼ / Src相同領域3 / Fyn / GST融合タンパク質 / ダブルチロシンモチーフ |
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| 研究概要 |
本年度は、タンパク質チロシンキナーゼの活性化によるシグナル伝達において、シグナル伝達・変換タンパク質の分子会合を仲介するSrc相同領域3(SH3)の新しいリガンドタンパク質をクローン化した。この目的のために、シグナル伝達タンパク質Src、Fyn、Lck、Vav、PLCgamma2およびPI3'-Kinase p85の各々に存在するSH3領域cDNAをPCR法で調製し、pGEXベクターに組み込みGST融合タンパク質を得た。このSH3領域とGSTとの融合タンパク質をビオチン化し、SH3領域結合タンパク質をcDNAライブラリーでスクリーニングする際のプローベとして用いた。スクリーニングには、マウス胎児cDNAのlambdaEXloxライブラリーを用いた。現在までのスクリーニングにより、FynのSH3に結合するクローンを1個得た。このクローンが発現するタンパク質は、FynのSH3と特異的に結合する371個のアミノ酸から成っていた。その構造中には、プロリンの多いSH3結合部位と思われる配列が2ケ所に存在した。現在このクローンの5′側を含めた全塩基配列の決定と特異坑体の調製を行っている。T細胞受容体/CD3複合体のチロシンリン酸化zeta鎖およびepsilon鎖に結合するタンパク質のクローン化は、昨年度から継続して研究している。zeta鎖およびepsilon鎖にあるダブルチロシンモチーフの2個のチロシンを共にリン酸化することが重要と考え、十分量のATPを基質として用いリン酸化反応を行い、これをビオチン標識してプローベとした。これを用いて、上記cDNAライブラリーをスクリーニングした所、陽性クローンを得ることが出来た。
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