ナトリウムポンプ遺伝子の筋分化に伴う発現制御機構

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04670152
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 川上 潔 自治医科大学, 医学部, 助教授 (54191016)
• キーワード: ナトリウムポンプ / 筋細胞 / 遺伝子発現制御 / Eボックス / Spl / T4DNAポリメラーゼフットプリント法 / DNA湾曲

研究概要

ナトリウムポンプalpha2サブユニット遺伝子の筋分化に伴う転写制御機構を知る為に、本遺伝子の転写制御領域をL6筋芽細胞への形質転換法にて同定した。転写開始点の上流-175から-108の間に8〜10倍の転写促進領域を見出した。本領域中には2ケ所のEボックスとSplコンセンサス配列及びGGGAGG配列が見出されたので、各部位に特異的な変異を導入し、制御へのかかわりを検討した。その結果、上流のBボックスは負制御エレメントとして作用し、Snlコンセンサス配列とGGGAGG配列は正の制御エレメントとして作用することが明らかになった。各エレメントを通して作用する転写因子を同定するために、L6細胞核抽出液を調製し制御領域DNA断片(-175〜-104)をプロープにゲルシフト法、D Nase I フットプリント法、メチル干渉法にて結合因子を解析した。その結果、2つのEボックスに結合する因子の存在、及びSplコンセンサス配列とGGGAG配列にまたがった広い領域にSpl結合すること、を見出した。Splの結合様式をさらに解析するため、Splコンセンサス配列、GGGAGG配列の各々に変異を導入してゲルシフト阻害実験を行うと、結合そのものに変化はなく、親和性が低下することが明らかとなった。さらに、T4DNAポリメラーゼフットプリント法にてSplの結合領域を解析したところ、3ケ所の結合部位が見出され、上記の解析で見出した広い領域への結合が3つの結合状態の混合物であることが強く示唆された。このことからSpl結合がKinetic Synergismによって転写促進に作用する可能性が示された。さらに、Splの結合がDNAに湾曲を引き起こすことも、湾曲検出ベクターを用いたゲルシフト法によって発現した。このように、ナトリウムポンプalpha2サブユニット遺伝子の転写制御エレメント及び因子の同定とそのDNA結合様式の詳細な解明を行い、本遺伝子の制御機構の分子レベルの理解に大きな基礎づけができた。

研究成果

• [文献書誌] IKeda,K: "Anomalous interaction of Spl and specific binding of an E-box-binding protein with the regula tory elements the Na,K-ATPase alpha2 suhunit gene promoter." Eur.J.Biochem.218. 185-204 (1993)
• [文献書誌] IKeda,K: "Possible implications of Spl-induced binding of DNA synergistic activation of transcription." Gene. 136. 341-343 (1993)
• [文献書誌] Watanabe,Y: "Transcription factors positively and negatively ragulating the Na,K-Tpase alphal subunit gene." I.Biochem.114. 849-855 (1993)
• [文献書誌] Kawakami,K: "Different factors bind to the regulatoy region of Na^+,K^+-ATPase alphal subunit gene inn cell cycle." FEBS Lett. 335. 251-254 (1993)
• [文献書誌] Kawakami,K: "Spl binds to the Adhesion Molecule on Glia regulatory elementl that functions as a positive transcription regulatory element in astrocytes." J.Neurosci.Res.35. 138-146 (1993)
• [文献書誌] Oguchi,A: "Regulation of Na.K-ATpase gene expression by aldosterone in vascular smooth muscle cells." Am.J.physiol. 265. 1167-172 (1993)
• [文献書誌] Yamamoto,K: "Regulation of Na.K-adenosine triphosphatase gene expression by sodium ions cult ured neontal rat cardiocytes." J.Clin.lnvest.92. 1889-1895 (1993)
• [文献書誌] Ohara,T: "Thyroid hormone stimulates Na^+-K^+-ATPase gene expression in cultured rat mesangialcells." Am.l.Physiol. 265. F370-F376 (1993)
• [文献書誌] Tsuruya.Y: "Altered Na.K-ATPase mRNA Expression in Spontaneously Hypertensive Rats" Hypertens Res.16. 269-274 (1993)
• [文献書誌] Kawakami,K: "Identfication and characterization of the cis-elements regulating rat AMOG (Adhesion Molecule on Glia)Na.K.-ATPase beta2 subunit,gene." J.Biochem. 111. 515-522 (1992)
• [文献書誌] Suzuki-Yagawa,Y: "Housekeeping Na,K-ATPase alphal subunit gene promoter is composed of multiple cis-elements to which common and cell type specific factors bind." Molec.Cell.Biol. 12. 4046-4055 (1992)
• [文献書誌] Kamitani,T: "Regulation of Na.K-ATPase gene expression by thyroidhormone in rat cardiocytes." Circulation Res.71. 1457-1464 (1992)