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【1】GM3合成酵素の単離精製:
シアル酸は糖脂質や糖蛋白質の糖鎖非還元性末端に存在し、細胞接着や細胞間相互作用さらには循環系における老廃物の除去など生物認識に重要な役割を果たしている。しかしながら、このような機能を持つシアル酸の発現制御機構に関しては未だ不明な点が多い。本研究では複合糖質鎖へのシアル酸の付加に関与するシアル酸転移酵素の簡便な測定法を開発し、これを用いて多様な生理活性を持つGM3合成酵素の単離精製を試みた。はじめに逆相薄層クロマトグラフィーとバイオイメージングアナライザーを組みあわせた簡便な活性測定法を開発した。GM3合成酵素はCMP-シアル酸(CMP-NANA)を糖供与体とし、NeuAcを受容体ラクトシルセラミド(Lac-Cer)の末端ガラクトース残基3位OH基に付加する反応を触媒する。本方法ではシアル酸部分にアイソトープ標識したCMP-NANAを用いて反応させた後、反応液を前処理なくそのままC18逆相系薄相クロマトグラムプレートに添加し、水にて展開後原点に残った反応産物をイメージアナライザーで放射活性を定量する手順をとる。本法はこれまで数日かかっていた測定を数時間以内で処理できるとともに、多くの試料を容易に処理できる利点をもつ。この方法を用いて、豚顎下腺GM3合成酵素の精製を進めた。抽出に用いる界面活性剤を検討したところTriton X-100が効果的であることが分かった。不安定である抽出酵素はグリセロールにより安定化されることが分かった。またいくつかのクロマトグラフィー担体を検討したところ、P11陽イオン交換クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過法が有効であることがわかった。
【2】ラット肝臓ゴルジ装置シアル酸転移酵素による新規ガングリオシドGD1αの合成:
きわめて微量しか存在しないとαシリーズガングリオシドの一つであるGD1αを、アシアロGM1を基質としてラット肝臓ゴルジ装置シアル酸転移酵素を利用して試験管内で合成することに成功した。さらに、Salmonella sialidaseを用いて各種ガングリオシドへの作用を調べた結果、末端α2-3結合シアル酸のみを切断することがわかりガングリオシド構造研究に極めて有効であることがわかった。
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