| 研究概要 |
我々はretがん遺伝子導入トランスジェニックマウスを作製し、神経堤細胞由来のmelanocytic tumorを発生する系を確立している。この腫瘍より細胞株(Mel-ret)を樹立し、細胞中のチロシン燐酸化蛋白を解析した結果、85kDaの蛋白が著しくチロシン燐酸化を受けていることが判明した。本年度はこの85kDa蛋白の精製を試み、その生化学的解析を行った。方法としてはMel-ret細胞の膜分画を1MNaCl,1%TritonX存在下で可溶化し、チロシン燐酸化蛋白を抗フォスフォチロシン抗体カラムに結合後、phenyl-phosphateで溶出した。その結果、90%以上のpurityで85kDaチロシン燐酸化蛋白が精製されることが判明した。この粗精製の85kDa蛋白を用いてin vitro kinase assayを行うと、主に85kDa蛋白のみに^<32>Pの取り込みが見られ、この蛋白自身にキナーゼ活性が存在することを示唆した。キナーゼ活性はMn^<2+>存在下においてMg^<2+>存在下におけるよりも数倍強かった。85kDa蛋白のキナーゼ活性は、ゲル内燐酸化反応によって同様に85kDa蛋白中に^<32>Pが取り込まれたことからも支持された。In vitro kinase assayで燐酸化を受けた85kDa中のアミノ酸はMn^<2+>存在下ではチロシン残基が、Mg^<2+>存在下ではチロシンとセリン残基が燐酸化を受けていた。今後は85kDa蛋白を大量に精製し、アミノ酸配列を決定し、cDNAクローニングを行う予定である。
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