| 研究概要 |
Trypanosoma b.gambienseのオリジナルな安定した変異表面抗原(VSG)KuTat1.1のmRNAをオリゴdTマグネットにより集め,それをもとに,cDNAライブラリーをつくった。日本住血吸虫のグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子をもつプラスミドベクターにcDNAを入れ,大腸菌内でGST-VSGの融合蛋白質を発現するような発現ベクターを作成した。抗KuTat1.1モノスペシフィックな抗体で大腸菌コロニーを選択した。KuTat1.1遺伝子を複数得たが,塩基配列決定を試みると,読み枠をずらしていずれの読み枠にしても,終止コドンと認識される並びが含まれており,正しい塩基配列を決定するのが困難であった。一つだけ5′側から全体の約1/5に当たる347番目まで塩基配列を決定することができた。その配列からKuTat1.1に特異的であると思われる18塩基を3′側のプライマーとした。一方,5′側のプライマーとしては,トリパノソーマのmRNAの5′側に存在するミニエクソン部の塩基配列中の18塩基をプライマーとした。それらを用いてRT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction.)を試みたところ,KuTat1.1に特異的であるはずだが,KuTat1.1クローンだけでなく,KuTat1.2クローンでもPCR産物が生じ,その産物を与える原虫最小限界数の比が,たかだか,1:1000であった。目的の検出感度である10^<-4>以下のオーダーにはおよばない。KuTat1.2のVSG遺伝子も同じ理由で塩基配列が決められないでいる。これとKuTat1.3についての塩基配列が得られれば,より特異的なプライマーが得られるはずである。現在ミニエクソン部のプライマーと,VSG遺伝子3′側に共通な部分のプライマーを用いてRT-PCRによる遺伝子のクローニングも試みている。
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