| 研究課題/領域番号 |
04670358
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
玉置 嘉広 大分医科大学, 医学部, 教授 (20028377)
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| 研究分担者 |
福田 昌子 大分医科大学, 医学部, 助手 (00156788)
岸田 哲子 大分医科大学, 医学部, 助教授 (50136793)
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| キーワード | DNAフィンガープリント / ユニバーサルプローブ / 親子鑑定 |
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| 研究概要 |
プローブ毎に標識する必要をなくすために、非標識一次プローブと標識二次プローブから成る、DNAフィンガープリント用ユニバーサルプローブシステムを開発した。一次プローブとしてヒトのサブゲノムライブラリーから選抜した組換えDNAクローンの一本鎖を、二次プローブとしてアルカルフォスファターゼ標識ベクター特異的オリゴヌクレオチド(市販品)を用いた。
ヒト骨髄腫細胞DNAのEcoRI消化物から分取した1-2kb断片をpUC118に組み込んでサブゲノムライブラリーを作製した。これを、M13ファージやJeffreysの33.6プローブの反復領域コア配列でスクリーニングすることによって、1.5kbのDNAフィンガープリントプローブ(YA1.5)を単離した。これをインサートとする組換えクローンで形質転換した大腸菌を液体培養し、ヘルパーファージM13KO7を感染させて、PUC118の一本鎖を得、これを一次プローブとした。
親子鑑定事例の被検者トリオから抽出したゲノムDNAのHinfI断片をアガロース電気泳動した後、ニトロセルロース膜にサザントランスファーした。先ずこのターゲットDNAと前記の一本鎖pUC118をハイブリダイズさせた後、二次プローブを一次プローブのベクター部分とハイブリダイズさせ、アルカリフォスファターゼの基質で発色させた。その結果、明瞭なDNAフィンガープリントを得ることができ、父子関係の存否の判定は、血液型検査による判定と一致した。今後、新しいプローブの単離、検査例数の追加、市販DNAフィンガープリントプローブによるフィンガープリントパターンとの比較を行う予定である。
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