| 研究概要 |
ヒト骨髄腫細胞から抽出した高分子DNAを制限酵素EcoR1で消化し、消化物をアガロース電気泳動によって分離した.ゲルから分取した1〜2kbの断面をファージミドpUC118に挿入し、大腸菌MV1184に形質転換した後低密度でプレート培養した.任意の組換えクローンのインサートをユニバーサル・プライマーP7およびP8でPCR増幅兼ビオチン標識した.これをプローブに使って残りのクローンを選別することを繰り返して陽性クローンを選抜した.陽性クローンの一つを鋳型として、その1.8kbのインサートをPCRによってビオチン標識した.これを予備的に親子のトリオのDNA断片を使ってテストしたところ、DNAフィンガープリント・プローブ(YA1.8と仮称)として使えることがわかった.Sanger法によってこのプローブの全塩基配列を決定したところ.市販のプローブの特許を侵害しない、全く新しいプローブであることがわかった。(論文投稿中).
この組換えファージミドを含む大腸菌を液体培養し,ヘルパー・ファージM13K07を感染させてファージミドの一本鎖を得,これを一次プローブとして用いた.二次プローブとして,アルカリフォスファーゼで標識されたpUC118特異的オリゴヌクレオチド(市販品)またはジコキシゲニンで末端標識したP7相補鎖を用いた.後者を用いた場合は,それをアルカリオスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体で検出した.
電気泳動後のサザンブロットを一次プローブ,次いで二次プローブとハイブリダイズさせ、DNAフィンガープリントをNBTとBCIPで発色させた.
親子のトリオと無血縁者のDNAサンプルを標的として市販のプローブとの比較テストをした結果,YA1.8は前者とは異なるDNAフィンガープリントを検出し.市販品に匹敵する有用性を示した.
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