ヒト肝3α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素の胆汁酸結合能と酵素学的検討

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04670444
• 研究機関: 帝京大学
• 研究代表者: 滝川 一 帝京大学, 医学部, 助教授 (70197226)
• キーワード: 3α-hydroxysteroid dehydrogenase / 胆汁酸結合 / dihydrodiol dehydrogenase

研究概要

ヒト肝よりの3α-hydroxysteroid dehydrogenase(3α-HSD)の精製は以下のように行った。なお、各精製過程においては、各カラムフラクションにつき、OD_<280>、3α-HSDおよびdihydrodiol dehydrogenase(DDH)活性とリトコール酸(LC)の結合を測定した。臓器提供者の肝臓から33%ホモジェネートを作成し、100、000gで超遠心しサイトゾールを得た。これをSephadex G75 superfineカラム(5x100cm)にかけ、3α-HSDとDDH活性を有するY'分画(分子量30,000-40,000)を得た。これをAffigel blueカラムにかけ、燐酸バッファーによるgradientにより溶出したところ、2つのLC結合ピークが認められ、最初のピークにはDDH活性のピークが、2つのLC結合ピークの間には3α-HSD活性のピークが認められた。Affigel blueの3α-HSD活性を含む分画をPBE74によるクロマトフォーカシングで分離すると、pH6.0、5.7および5.4に3つの3α-HSDとDDH活性を有するピークが認められた。なお、LC結合はこれらのピークには認められず、より高いpHに3つのピークとして溶出され、そのうちの最も高い結合ピークはbile acid binderと考えられた。これら3つの3α-HSDピークをhydroxyapatite-HPLCでさらに精製するとSDS-PAGE上、すべて分子量36,000の単一バンドを示す蛋白が得られた。各種胆汁酸を基質としてこれらの酵素のenzyme kineticsを検討すると、3つの酵素とも見かけ上のKmはケノデオキシコール酸で1μM、コール酸で40μM程度であり、ラット肝3α-HSDと同程度であった。以上の結果から、ラット肝と異なり、ヒト肝では3α-HSDはbile acid binderとは別に存在し、酵素学的性格はラットに類似するものの胆汁酸結合のは持たず、ヒト肝内での胆汁酸の輸送にはbile acid binderが重要な役割を持つものと考えらた。

研究成果

• [文献書誌] H.Takikawa,N.Sano M.Minagawa,M.Yamanaka: "Effects of ursodeoxycholate,itsglucuronide and disulfate and β-muricholate on biliary bicarbonate concentration." J.Hepatol.15. 77-84 (1992)
• [文献書誌] H.Takikawa,K.Fujiyoshi K.Nishikawa,M.Yamanaka: "Parification of 3α-Hydroxysteroid and 3β-hydroxysteroid dehydrogenases from human liver." Hepatology. 16. 365-371 (1992)
• [文献書誌] H.Takikawa,S.Arai M.Yamanaka: "Lithocholate binding by Y and Y' proteins in bovine small intestine." Arch.Biochem.Biophys.298. 486-491 (1992)
• [文献書誌] N.Sano,H.Takikawa M.Yamanaka: "Estradiol-17β-glucaronide induced cholestasis:Effects of ursodeoxycholate-3-O-glucuronide and 3,7-disulfate" J.Hepatol.17. 241-246 (1993)
• [文献書誌] H.Takikawa,T.Minagawa N.Sano,M.Yamanaka: "Lithocholate-3-O-glucuronide induced cholestasis.As tudy with congenital hyperbilirubinemic rats." Dig.Dis.Sci.(1993)
• [文献書誌] H.Takikawa,N.Sano Y.Wako,M.Yamanaka: "Effects of organic anions and bile acids on biliary lipid excretion in hyperbilirubinemic mutont rats." J.Hepatol.17. 247-252 (1993)