単離心筋細胞膜のNa^+/Ca^<2+>交換系に及ぼすhypoxiaの影響とその抑制機序

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04670557
• 研究機関: 東京慈恵会医科大学
• 研究代表者: 望月 正武 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (20130205)
• キーワード: Na^+ / Ca^<2+>交換系 / hypoxia / 虚血 / Fura2 / 細胞内Ca / 細胞内Na / アシドーシス / Na / H交換系

研究概要

心筋細胞の不可逆性の原因の一つと考えられる細胞内Ca^<2+>([Ca^<2+>]_i)上昇の機序について主にNa/Ca交換系の関与とその調節機構を検討することが本研究の目的であり、Na/Ca交換系のreverse mode(Caのinflux)は灌流液のNaをTMA^+で置換して0Naとした時の[Ca^<2+>]_iの上昇を指標とした。さらにcaffeineを短時間投与した場合一過性にSRからCaが放出され[Ca^<2+>]_iは増加するが、その後Na/Ca交換系のforward mode(Caのefflux)が作動して[Ca^<2+>]_iは減衰していく現象を利用してNa/Ca交換系のforward modeの指標とした。これらはそれぞれNa/Ca交換系阻害薬(Ni^<2+>)で抑制されることを確認した。またhypoxiaはO_2 100%からN_2 100%のbubblingに転換して行い、細胞内acidosisの作成は15mM NH_4Clを投与し、次にこれを除去することで行った(pH_iは7.2から6.8まで低下)。灌流液中のCa濃度は2mMと4mMのものを用いた。さらに虚血あるいはhypoxia時の細胞内acidosisによりNa/H交換系が重要な役割を果たすため虚血中あるいはhypoxia中に灌流液中にその阻害薬であるアミロライドを投与し、細胞内外pH_i,Ca,Naを測定した。[Ca^<2+>]_i,pH_i,[Na^+]_iは各々の蛍光色素であるFura2,BCECF,SBFIを負荷して測定した。
hypoxia時のNa/Ca交換系はforward modeもreverse modeも好気的な状態のそれと比較して有意に抑制された(約50%)。[Ca^<2+>]_iは2相性の上昇を示し(約200μMから700μMに上昇)、後半の[Ca^<2+>]_iの上昇はNaチャネル阻害薬で抑制された。[Na^+]_iは虚血後緩徐に上昇し、再灌流で前値に復した。pH_iは7.2から3分後には6.8、10分後には6.6まで低下した。アミロライドを虚血中に投与することによりpH_iは有意に抑制され、再灌流障害、特に不整脈の発生が100%抑制された。
以上の成績より心筋が虚血あるいはhypoxiaに陥った場合、H^+_iの増加(pH_iの低下)が発生し、Na/H交換系を介して[Na^+]_iの上昇、続いてNa/Ca交換系特にforward modeの抑制のためにCaの汲み出しが障害され、[Ca^<2+>]_iは増加することが推測された。またNa/Ca交換系の阻害にpH_iが直接影響を与えていることも示された。

研究成果

• [文献書誌] Mochizuki S.,et al: "Ischemia-reperfusion injury and lipids:Effect of human high-and low-density lipoproteins on reperfusion arrhythmias." Cardiovascular Drugs & Therapy. 5. 269-276 (1991)
• [文献書誌] Jiang,C.,Poole-Wilson,P.A.,Mochizuki,S.,et al: "Effect of 17 β-oestradiol concentration.Ca^<2+> current and intracellular free Ca^<2+> in guinea-pig isolated cardiac myocytes." British Journal of Pharmacology. 106. 739-745 (1992)
• [文献書誌] Mochizuki,S.,et al: "The effect of hypoxia on cytoplasmic Ca^<++> during low Na^+ exposure in isolated cardiac myocytes from guinea pig." Journal of Physiology London. 446. 334 (1992)
• [文献書誌] Mochizuki,S.,et al: "Na^+/H^+ exchanger and reperfusion-induced ventricular arrhythmias in isolated perfused heart:Possible role of amiloride." Molecular and Cellular Biochemistry. 119. 151-157 (1993)
• [文献書誌] Mochizuki S,et al: "Attenuation of susceptibility to ischemia/reperfusion in isolated,substrate-free perfused heart from diabetic rats." The Adapted Heart.ed by Nagano M,Takeda N,Dhalla S Raven Press N.Y.423-429 (1994)
• [文献書誌] Jiang C,Mochizuki S,et al: "Effect of lemakalim on action potentials,intracellular calcium,and contraction in guinea pig and numan cardiac myocytes." Cardiovascular Research. 28. 851-857 (1994)
• [文献書誌] Nagano M,Mochizuki S,Dhalla N.S.: "Cardiovascular Disease in Diabetes." Kluwer Academic Publishers, 388 (1992)
• [文献書誌] Yazaki Y,Mochizuki,S,edited: "Biochemical and Molecular Mechanisms in Cell Function." Kluwer Academic Publishers, 220 (1993)