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蛍光pH指示薬であるBCECF(Dojin)と、蛍光分光光度計およびFlow cytometer(FCM)を用いて、pHiの測定の基礎的検討と温熱耐性細胞や非温熱耐性細胞を温熱処理した時のpHiの変化について調べた。
(1)pHiの測定;蛍光分光光度計(RF‐5000:島津)を用いて、BCECFで染色したSCK細胞についてpHiを求めた。また、FCM(FACStar)を用い、Nigericin/K^-法により検量線を作成した。pHiがpH6.5〜7.5の間で蛍光強度とpHには直線関係が存在し、pHiの測定が可能であった。
(2)pHeのpHiへの影響についての検討;細胞を浮遊させたHEPES緩衝液にNaOH又はHcl水溶液を添加し、pHeを6.5〜7.5まで約0.25pH Unitsづつ変化させpHiの変化を調べた。pHeをpH6.5〜7.5pH nuit変化させた時、pHiはpH6.6〜7.0を示し、0.4pHunitsの変化のみで細胞膜の作用により、pHeの変化に対して、pHiの恒常性が保たれた。
(3)加温中のpHiの経時的変化;細胞を浮遊させた緩衝液の温度を、37℃で分光光度計を用いて蛍光強度を測定したその後、緩衝液の温度を42℃〜44℃に上昇させて蛍光強度を経時的に測定すた。42度の加温ではpHe7.0でpHiが7.08から30分の加温で6.92までの低下を認め、44度の加温では6.86めでの低下を認めた。
(4)非温熱耐性細胞と熱耐性細胞についてpHeの違いによるpHiの変化を比較した。温熱耐性を獲得したSCK細胞は加温によるpHiの低下は非温熱耐性細胞に比べてpHiの低下が小さい事、及び37度の状況に戻すとpHiの上昇が認められた。
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