| 研究課題/領域番号 |
04670745
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
坂本 幸具 和歌山県立医科大学, 医学部消化器外科, 助手 (80215665)
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| 研究分担者 |
中井 健裕 和歌山県立医科大学, 医学部消化器外科, 助手 (70227726)
内山 和久 和歌山県立医科大学, 医学部消化器外科, 助手 (80232867)
石本 喜和男 和歌山県立医科大学, 医学部消化器外科, 講師 (40176227)
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| キーワード | 胆道感染症 / 化膿性腹膜炎 / B-lactamase / Acidimetry法 / HPLC法 |
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| 研究概要 |
胆汁検体においてABPCおよびCERを基質とするAcidimetry法を応用することにより、緩衝液中のβ-lactamase活性を分光光度計を用いてPenicillinase(PCase)とCephalosporinase(CEPase)に分別定量する方法を確立した。測定時の至適温度は25℃〜35℃、測定限界はPCaseで0.09mU/ml、CEPaseで0.05mU/mlと鋭敏であった。10倍以上希釈した胆汁では緩衝液とほぼ同様の測定値が得られ、他の胆汁成分の影響がおよそ除外できた。
腹水は緩衝能が非常に強く、Acidimetry法で用いる緩衝液と同等の緩衝能を得るためには、20倍以上の希釈が必用であった。測定限界はPCaseが2.0mU/ml、CEPaseが1.0mU/mlであり、添加回収率はPCaseが115±24%、CEPaseが113±26%であった。
本年度研究補助金により購入した高速液体クロマトグラフ用送液ポンプ(LC-10AD:島津製作所)とデータ処理装置(C-R4AD:島津製作所)を用いて、HPLC法により胆汁中β-lactamaseを基質特異性に基づいてCEPase、Cefuroximase(CXMase)、PCaseに分別定量する方法を新たに考案した。分離カラムはNucleosil 5C18(4.6mm¢×25cm:和光純薬)を用い、移動相はアセトニトリル:0.05Mリン酸緩衝液(pH6.5)15:85として逆相クロマトグラフィー法にて行った。カラム温度は30℃、流量は1.2ml/minとし、紫外分光光度計を用いてCEPaseの基質CERとCXMaseの基質CXMは254nmで保持時間5分と9分に、PCaseの基質PCGは220nmで17分に抽出され、1本のカラムで完全に分離できた。ただし、複数の基質を同時に加えると、お互いにβ-lactamaseによる分解を抑制するので、3種類のβ-lactamaseは別々に測定する必要があった。測定限界は0.05mU/mlと極めて鋭敏で、保持時間およびピーク面積のCV値はいずれも0.05%であった。CEPaseの添加回収率は88〜116%であった。
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