ヒト・プロラクチンの糖鎖構造の意義に関する研究

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04670998
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 菅沼 信彦 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30179113)
• 研究分担者: 福垣 洋行 名古屋大学, 医学部, 助手 (10252248) ; 近藤 育代 名古屋大学, 医学部, 助手 (40215447)
• キーワード: プロラクチン / アスパラギン結合糖鎖 / 発現ベクター / 塩基特異的突然変異作製法 / 遺伝子導入法

研究概要

1.平成4年度に、ヒト・プロラクチン(PRL)cDNAを挿入した発現ベクターを調製したが、本年度はそのベクターをCOS-1細胞に導入し、^<35>S-メチオニンにて標識することによりPRL産生クローンを選別した。そのクローンを用い約12時間^<35>S-メチオニンで標識し、細胞内および培養液中に産生・放出されたPRLを抗PRL抗体を用いた免疫沈降法により沈澱させた。この検体をSDS-アクリルアミド・ゲル電気泳動法により解析した。その結果、細胞内および培養液中共に糖鎖構造を有するあるいは有しないPRLが共に検出された。これらの割合は、細胞内・培養液中共に糖鎖構造を有しないPRLの方が多量であった。この結果からでは、糖鎖構造の有無によるPRL蛋白の分泌動態等における差異は明かではなく、その生理的意義を明確にはできなかった。
2.平成4年度ヒトPRLcDNAをMV1190ファージに挿入し、PRLcDNAを含む一本鎖DNAを調製した。この一本鎖DNAを鋳型としてアスパラギン・コドン(AAC)をアスパラギン酸・コドン(GAC)に変換した27塩基の合成ヌクレオチドを結合させ、二本鎖DNAを合成した。ヌクレアーゼ選別法により変異DNAを選択し、DNAシークエンシング法により塩基の変換を確認した(塩基特異的突然変異作製法)。今後、このDNAを発現ベクターに挿入、クローニングし、上記のように有核細胞に導入することにより糖鎖構造を全く欠いたPRLが純粋な形で得られ、その解析によりPRLにおける糖鎖構造の意義がさらに解明されうると考えられる。
3.PRL遺伝子発現の調節因子と考えれるPit-1およびpoly(adenosine diphosphate-ribose)合成についても研究を行い、また高PRL血症に関する臨床的な検討も行った。

研究成果

• [文献書誌] 菅沼信彦: "高プロラクチン血症の治療" 臨床婦人科産科. 46. 410-412 (1992)
• [文献書誌] 塚原慎一郎: "ヒトPit-1遺伝子上のPou-Box領域のクローニング" 名古屋大学環境医学研究所年報. 43. 160-163 (1992)
• [文献書誌] 菅沼信彦: "プロラクチン値の評価" 臨床婦人科産科. 47. 1176-1177 (1993)
• [文献書誌] Tsukahara,S.: "Cloning of the human Pit-1 Pou-Box" Environ.Med.36. 55-58 (1992)
• [文献書誌] Suganuma,N.: "Poly(adenosine diphosphate-ribose)synthesis in the anterior pitultary of the female rat throughout the estrous cycle:Study of possible relation to cell proliferation and prolactin gene expression." Endocrind.Invest.16. 475-480 (1993)
• [文献書誌] Tsukahara,S.: "Increase in Pit-1 mRNA is not required for the induction of the PRL gene expression by estrogen." Environ.Med.37. 35-38 (1993)
• [文献書誌] 菅沼信彦: "「不妊症治療のための生殖医学実験マニュアル」第3章-9.核酸実験" (株)南江堂, 24 (1993)