| 研究課題/領域番号 |
04671401
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
小森 慎二 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (60195865)
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| 研究分担者 |
多養 哲治 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (60248151)
山崎 則行 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (50174644)
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| キーワード | アンドロゲン不応症 / アンドロゲンレセプター / 遺伝子解析 / PCR / 突然変異 |
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| 研究概要 |
1.AIS症例よりのDNA分離:アンドロゲン不応症(AIS)をしめす4名の患者の末梢血より高分子DNAの分離に成功した。
2.Primerの合成:既に報告されているアンドロゲンレセプター(AR)のゲノム遺伝子を参考にして、polymerase chain reaction(PCR)法のprimerを合成した。
3.PCR法によるAR遺伝子の解析:上記primerと患者由来の高分子DNAを基にして、PCR法によりARの各エクソンを増幅分離した。増幅したDNA産物をPCR-SSCP法を用いてその泳動パターンを正常AR遺伝子と比較する事により異常AR遺伝子の検出を試みた。その結果、1症例でGエクソンに泳動のパターンの異常を発見した。現在さらに他のエクソンについて検索を行っているところである。
4.DNA塩基配列の決定:分離した各エクソン遺伝子をM13ベクターに組み込みDNA塩基配列を決定した。その結果1症例にてGエクソンに突然変異を同定した。それによりアミノ酸がグリシンよりアラニンへ置換していることが判明した。さらに他の1症例にて、Eエクソンに異常を発見した。現在その異常を再度確認しているところである。
5.突然変異AR遺伝子の作製及び細胞への導入:我々が同定した突然変異の部位が実際にAISの原因として重要となりえるかを、in vitroの実験系で確認するため、既に我々が所有する正常ARのcDNAを元に、site-directed mutagenesis法にて突然変異の作製を現在行っている。また正常AR遺伝子を、発現ベクターpSG5に組み込み、エレクトロポレーション法にて動物細胞COS-1に導入して、それら細胞よりRNAを抽出して、northern blot analysisを行い、導入の条件を検討した。現在さらにAR蛋白の発現量も検討しているところである。
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