| 研究概要 |
細胞の活性化と、細胞内pH(pHi)は密接な関係があり、一般に細胞が活性化されるとpHiは上昇する。本研究の目的は、フローサイトメトリーを用いて、pHiをサブセット毎に測定できる系を確立し、細胞の生理機能や病態の解析に役立てようとするものである。
1.健常人末梢血を用いた基礎的条件の設定
比重遠心法により得られたリンパ球に加えて、全血を用いた白血球全分画(好中球・単球・リンパ球)のpHiを同時に測定する方法について検討した。pHiは2',7'-bis(carboxyethyl)-5,6-carboxy-fluorescein(BCECF)を細胞にloadして測定し、calibrationはnigericin/potassium法が可能であった。
2.細胞表面抗原とpHiの二重染色の検討
リンパ球のサブセット毎のpHiを測定する方法として、BCECFをload後に表面抗原を染色するのが良く、表面抗原に対するモノクローナル抗体に標識する蛍光色素はperidinin chlorophyll protein(PerCP)が最適であった。
3.pHiの経時的変化の測定
細胞活性化の時間的変化を見るために、ラット脾細胞をmitogenで刺激後、コンピューター・ソフトを用いて経時的に観察することが可能であった。それにより、PHAとConAで活性化の動きが異なることが示唆された。
4.細胞サブセット毎のpHiの経時的変化
ConA刺激後のラット脾細胞において、CD4,CD8陽性細胞のpHiの経時的変化を、それぞれ別個に観察可能にした。ただしこの場合、mitogen刺激による細胞の大きさの変化のfactorがかぶっている可能性があり、その補正が今後の課題である。
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