| 研究概要 |
サンドイッチ法による低分子ペプチドホルモンの酵素免疫測定法(EIA)は困難であるとされてきたが、本研究では視床下部ホルモン(growth hormone-releasing hormone,GHRH;somatostatin,SRIF)について非競合法による超高感度EIAを試みた。
特異抗体は、家兎を抗原・担体複合体で免疫し作製した。GHRHではC端部に特異性の高い抗体を得ることができたが、N端部に特異性の高い抗体は得られなかった。SRIFについても、当初の計画ではN端部とC端部に特異性の高い2種類の抗体を用いて測定系を確立する予定であったが、中央部を認識する抗体のみ得られた。これらの抗血清よりアフィニティークロマトグラフィーでIgG分画を精製し、EIAに供した。
EIAは1種類の特異抗血清による抗原抗体反応と、アビジンとビオチンの高親和性を利用したサンドイッチ法により行った。まず、ペプチドホルモンのアミノ基にビオチンを導入しビオチン化ペプチドを作製した。この両端に、プレートに固相化したアビジンおよび上記精製特異抗体を反応させた。さらに、酵素標識二次抗体(goat anti-rabbit IgG-peroxidase conjugate)およびo-phenylenediamine(OPD)による可視部の発色系(420nm)を用いる測定系で反応性を検討した。その結果、GHRHとSRIFのEIA系とも良好な用量反応曲線が得られ、その測定感度はGHRH 5.0pg/tube、SRIF 0.61pg/tubeで、既報のラジオイムノアッセイによる高感度な測定系と同等かそれ以上の感度を得ることができた。この測定系を用いて正常人の血漿濃度を測定したところ、血漿GHRH濃度は27±9.7pg/ml、血漿SRIF濃度は15±6.4pg/ml(mean±SD)であり、従来の報告値とほぼ同じ値を示した。
問題点として、EIAの開発の際、良好な用量反応曲線が得られても非特異的な反応に伴うOPDの発色が強かったが、正常ヤギ血清(10%)の添加と非特異反応が少ない抗血清の使用により、非特異的発色を抑えることができた。ただ、最初に目標としたほどの感度の向上は得られなかった。将来的にはOPDによる発色系の代わりに、蛍光法(320nm,405nm)を用い、測定感度を良くする方法を考えたい。また検体中のビオチン化ペプチドを、特異抗体吸着(固相化)ポリスチレンボールと結合させたのち解離させる方法を試み、非特異的反応を少なくすることも検討した。しかし、現時点では特異抗体吸着ポリスチレンボールとビオチン化ペプチドの結合に問題があるため、この結合条件をよくする方法について検討中である。
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