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NO合成酵素は脳型、マクロファジ型、内皮型の三種が知られ、それぞれ精製され、その一次構造は知られている。それぞれ生理的には、非常に重要な役割が知られ注目されている酵素である。又それぞれFAD、FMN、P-450型ヘム、ビオプテリン、カルモジュリンをもつ複雑な酵素であり、反応機構、調節機構も興味がもたれている。その内脳型はカルモジュリンとの結合が比較的弱いため、酵素反応にはこの物質を加える必要があるため、カルモジュリン依存型といわれ、その他は、否依存型として分類されている。しかし酵素が不安定であり、含量も少ないため、大量の精製酵素が得難く、それぞれ補欠分子族の役割と反応機構の詳細は十分わかっていない。今回、酵素反応機構を検討するに値する量の脳型酵素の大量精製を試みた。又同時に簡便な活性測法がないため、一年目は酵素測定法の簡便かつ、高感度の方法を確立した。 ^<14>C-アルギニンを基質として反応后生成物をTLCにて展開し、イメージアナライザーでシツルリンの放射活性を測定し、多数の反応組成液を同時に効率よく測定する方法を確立した。又今まで行われて来たネズミ脳からの精製方法を改良し牛脳から高収率で得られる方法を検討した。酵素は極めて不安定であり、3時間4℃で約半分に失活する。それは蛋白分解によるより別の要因である事をウエスタンブロットの解析は示していた。そのため、安定化させるため種々の条件検討を行い、殆ど失活しない組成液が検討できた。それを利用し、酵素の精製を行い、300μgの高比活性の酵素が得られるようになった。今まで難しい点を改良したため、時間と労力を費やしたが、今回后の解析が可能となる大きな進歩が得られた。一方全長をコードしたCDNAの発現をE.Coliで試みたが、蛋白は出来ているものの、活性はなかった。しかし、発現蛋白を用いて多量の抗体を作製することがで来た。
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