1992 年度実績報告書

ファゴサイトシスにおける細胞内プロテアーゼの役割の解析

研究課題

研究課題/領域番号	04680180
研究機関	東京大学
研究代表者	大海忍東京大学, 医科学研究所, 助教授 (20160046)
研究分担者	土屋輝昌東京大学, 医科学研究所, 助手 (20242109)
キーワード	プロテアーゼ / 食細胞 / カルシウム / カルパイン / ファゴサイトシス / カルパスタチン
研究概要	カルパインは、高等動物のあらゆる細胞に存在する重要なタンパク質分解酵素と考えられているが、本酵素と細胞機能の関係は明らかになっていない。本研究では、食細胞機能とカルパインとの関係を知るために、カルパインの細胞内動態を細胞レベルで解析する方法を開発し、食細胞におけるカルパインおよびその内在性阻害タンパク質であるカルパスタチンの解析をおこなった。1.活性型カルパインに特異的な抗体の作成と細胞内タンパク質分解反応の新しい解析法の確立カルパインは細胞質に不活性前駆体として存在し、カルシウムイオン濃度の上昇などに伴って自己触媒的に末端部分が切断・遊離し活性型に変化する。ここでは活性型カルパインのアミノ末端領域の配列の短いペプチドを利用して、活性型カルパインに特異的な抗体を作成した。この抗体は、前駆体型カルパインには全く反応せず、組織・細胞レベルでの活性型カルパインの検出に有効であると考えられる。2.前駆細胞の食細胞への分化誘導におけるカルパインの動態マクロファージの前駆細胞であるU937培養細胞を種々の分化誘導剤で刺激したときの細胞内におけるカルパインの活性化を先に作成した抗体を用いて解析した。分化誘導後のスーパーオキシド産生能を指標に細胞を破砕し、活性型カルパインの生成量を調べると、活性型は細胞全体の前駆体カルパインの0.1%以下であった。また、種々のカルパイン阻害剤を分化誘導時に加えてもこれを抑える作用を示さなかった。さらにカルパスタチンは、量質ともに変化しなかった。3.食細胞の活性酸素産生能とカルパインの関係食細胞のスーパーオキシド産生や脱顆粒にカルパインが関与しているという報告があるので、正常人末梢血好中球のスーパーオキシド産生能に対するカルパイン阻害剤の影響を調べた。好中球をカルシウムイオノフォアおよび走化性ペプチド(fMLP)で刺激すると、スーパーオキシドが産生されるが、細胞をあらかじめ阻害剤で処理しておいてもスーパーオキシドの産生量に変化は認められなかった。したがって、カルパインは、食細胞のスーパーオキシド産生には直接関係していないと考えられる。

研究成果
(8件)

すべてその他

すべて文献書誌 (8件)

[文献書誌] Imajoh-Ohmi,S 他: "Topology of cytochrome b_<558> in neutrophil membrane analyzed byanti-peptide antibodies and proteolysis" J.Biol.Chem.267. 180-184 (1992)
[文献書誌] Kamakura,K.他: "Distribution of calcium-activated neutral protease inhibitor in the central nervous system of the rat" Neurosci.Res. 31. 543-548 (1992)
[文献書誌] Nakanishi,A.他: "Direct evidence for interaction between COOH-terminal regions of cytochrome b_<558> subenits and sytosolic 47-kDa protein during activation of an 0_2-generating system in neutrophils" J.Biol.Chem.267. 19072-19074 (1992)
[文献書誌] Saito,Y.他: "Possible involvement of clathrin in neuritogenesis induced by a protease inhibitor(benzyloxy carbonyl-Leu-Leu-Leu-aldhyde)in PC12 cells" J.Biochem.112. 448-455 (1992)
[文献書誌] Kikuchi,H 他: "Novel autibadies specific for proteolyzed forms of protein kinase C:Production of antipeptide autibodies available for in situ analysis of intracellular limited proteolysis" Biochem.Biophys Acta. (1993)
[文献書誌] Shiota,M.他: "Expression of cytochrome b_<558> on B cell-and CD30 positive-lymphomas" Pathol.Res.Practice. (1993)
[文献書誌] 大海忍(分担執筆): "遺伝子工学実験法" 中外医学社, (1993)
[文献書誌] 榎森康文: "アルパインとカルパスタチン,構造と機能" 日本生化学会, (1992)

1992 年度 実績報告書

ファゴサイトシスにおける細胞内プロテアーゼの役割の解析

研究代表者

大海 忍 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (20160046)

研究成果

[文献書誌] Imajoh-Ohmi,S 他: "Topology of cytochrome b_<558> in neutrophil membrane analyzed byanti-peptide antibodies and proteolysis" J.Biol.Chem.267. 180-184 (1992)

[文献書誌] Kamakura,K.他: "Distribution of calcium-activated neutral protease inhibitor in the central nervous system of the rat" Neurosci.Res. 31. 543-548 (1992)

[文献書誌] Nakanishi,A.他: "Direct evidence for interaction between COOH-terminal regions of cytochrome b_<558> subenits and sytosolic 47-kDa protein during activation of an 0_2-generating system in neutrophils" J.Biol.Chem.267. 19072-19074 (1992)

[文献書誌] Saito,Y.他: "Possible involvement of clathrin in neuritogenesis induced by a protease inhibitor(benzyloxy carbonyl-Leu-Leu-Leu-aldhyde)in PC12 cells" J.Biochem.112. 448-455 (1992)

[文献書誌] Kikuchi,H 他: "Novel autibadies specific for proteolyzed forms of protein kinase C:Production of antipeptide autibodies available for in situ analysis of intracellular limited proteolysis" Biochem.Biophys Acta. (1993)

[文献書誌] Shiota,M.他: "Expression of cytochrome b_<558> on B cell-and CD30 positive-lymphomas" Pathol.Res.Practice. (1993)

[文献書誌] 大海忍(分担 執筆): "遺伝子工学実験法" 中外医学社, (1993)

[文献書誌] 榎森 康文: "アルパインとカルパスタチン,構造と機能" 日本生化学会, (1992)

1992 年度実績報告書

大海忍東京大学, 医科学研究所, 助教授 (20160046)

[文献書誌] 大海忍(分担執筆): "遺伝子工学実験法" 中外医学社, (1993)

[文献書誌] 榎森康文: "アルパインとカルパスタチン,構造と機能" 日本生化学会, (1992)