酵母染色体複製起点結合タンパク質および複製開始複合体についての生化学的研究

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04680182
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 正井 久雄 東京大学, 医科学研究所, 助手 (40229349)
• キーワード: DNA複製 / 複製起点 / DNA結合タンパク質 / GST融合タンパク質 / South-western / 複製開始複合体 / CDC7キナーゼ / リン酸化

研究概要

酵母の複製起点(ARS)に保存される11塩基対のコア配列に特異的に結合する酵母タンパク質を検索した結果、コア配列T-rich鎖一本鎖DNAに特異的に結合するタンパク質が核抽出液中に存在することを、gel shift assayおよびSouth-western法により確認した。それらをコードする遺伝子をクローニングするために酵母染色体DNAをGST融合ベクター、pGEX-3Xおよびその誘導体にクローニングし、GST融合タンパク質ライブラリーを作製した。このライブラリーをコア配列T-rich鎖を含むオリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングした結果、これまでにCBP-1およびCBP-2の2個のクローンを単離した。CBP-1タンパク質はgel shift assayにより野生型コア配列には結合するが、点変異をもつコア配列への結合は減少していることを確認した。
酵母核抽出液をATPγSの存在下で、A50mゲル濾過で分画した結果、void volumeに近い高分子量画分に外から添加したARS配列を含む環状DNAを複製する活性と内在性基質タンパク質をリン酸化する能力が共溶出することを見いだした。さらにCDC7タンパク質に対する抗体を用いたimmunoblottingにより同じ高分子量画分にCDC7タンパク質が存在することが明らかとなった。以上の事実は複製能をもつ高分子量タンパク質複合体(複製開始複合体)が核抽出液中に存在し、その中にG1からS期への移行を抑制すると考えられているCDC7キナーゼも含まれていることを示唆し、大変興味深い。

研究成果

• [文献書誌] Kubota et al: "“Roles of ΦX174 type primosome-and G4 type primase-dependent primings in initiation of lagging and leading strand syntheses of DNA replication"" Gene. (1993)
• [文献書誌] Nomura et al: "“Identification of eleven single strand initiation sequences(ssi)for DNA replication in F,R6K,R100,and ColE2 plasmids"" Gene. 108. 15-22 (199)
• [文献書誌] Masai: "“The ABC-primosome:a novel priming system employing dnaA,dnaB,dnaC,and primase on a hairpin containing a dnaA boX sequence."" J.Biol.Chem.265. 15134-15144 (1990)
• [文献書誌] Masai: "“Roles of the G site and ΦX174-type primosome assaembly site in priming leading strand synthesis:initiation by a mobile primosome and replication-fork arrest by RepA protein bound to oriR"" J.Biol.Chem.265. 15124-15133 (1990)
• [文献書誌] Lee et al: "“The priA gene encoding the primosomal replicative n' protein of Escherichia coli."" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 817. 4620-4624 (1990)
• [文献書誌] 正井 久雄: "DNA複製と細胞増殖" 化学と生物. 30. 495-501 (1992)