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clathrin coated vesicle及びnon clathrin coated vesicleの輸送にはadaptinやcoat proteinといった特徴的な蛋白質が重要であることがこれまで示唆されている。またリソゾームへの輸送機構についても類似した蛋白質の存在が予想される事から、数種の方法による検討を行なった。1)β-adaptin及びβ-COPのアミノ酸配列を比較し、PCR増幅を行なう為の条件に適合した二ヶ所の配列、すなわちラット肝β-COPアミノ酸40番目から46番目、及び112番目から117番目を選び出した。このアミノ酸配列に基ずいてDNA配列を予測し、この配列を有するDNA primerを合成した。これを、cDNAライブラリーを鋳型として緩やかな条件でPCR増幅を行ない、上記の二つの蛋白質に類似した新規の蛋白質のクローンを得る予定である。2)リソゾーム膜蛋白質のC末端側のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、この合成ペプチドを結合した親和性カラムを調製した。ラット肝臓の細胞質画分をこの親和性カラムにかけ、吸着する蛋白質の分離精製を試みた。この方法によって50kDaおよび90kDa付近の分子量を示す蛋白質が数種類得られた。これらの蛋白質については更にSephadex G200およびDE52を用いて分離を行なっている。50kDaの蛋白質については精製標品が得られたため、トリプシン処理を行なった後、アミノ酸配列を決定すると共にこの蛋白質に対する抗体をウサギを用いて作製した。今後、更に他の蛋白質についても検討を行ない、これらの蛋白質の関連について調べると共にリソゾーム形成における役割についての検討を行なっていくつもりである。
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