核局在化シグナル結合タンパク質の解析とそれに基づく核タンパク質輸送機構の解明

1992 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04833018
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 米田 悦啓 大阪大学, 医学部, 教授 (80191667)
• キーワード: 核局在化シグナル / 熱ショックタンパク質 / 核タンパク質輸送 / 核タンパク質 / マイクロインジェクション法 / 核膜孔

研究概要

これまで本研究者は、核タンパク質が核内に輸送されるために必要な配列である核局在化シグナルに特異的に結合するタンパク質として分子量69kDaの分子(p69)を同定し、完全精製することに成功していたわけであるが、その完全精製したp69の部分アミノ酸配列を決定したところ、熱ショックタンパク質の1つである70kDa heat shock cognate(hsc70)であることが明かとなった。精製hsc70に対する抗体を核タンパク質とともに培養細胞の細胞質にインジェクションすると、その核タンパク質の輸送は特異的に阻害された。さらに、この抗hsc70抗体の持つ阻害活性はヒトhsc70遺伝子を大腸菌で発現させて得られたhsc70タンパク質によって吸収されることから、hsc70に特異的であることが明かとなり、hsc70が核タンパク質の核内移行に重要な働きをしていることがin vivoで初めて示された。次に、hsc70の核タンパク質輸送における重要性を明確にし、その役割を明らかにするために、培養細胞をジギトニンで処理し、細胞質抽出液を反応系に加えるというsemi-intact細胞によるin vitro系を利用した。反応系に加えるべき細胞質抽出液を抗hsc70抗体を用いて処理し、hsc70を吸収した。hsc70を吸収した細胞質抽出液には核タンパク質を核内に輸送する活性はほとんどなく、精製hsc70を再添加することによりその活性は吸収前のレベルにまで回復した。このことから、hsc70が核タンパク質の輸送に関与していることがin vitro系において再確認された。さらに、このin vitro系において、核タンパク質の輸送が誘導された時、hsc70の局在がどうなるかを調べた。核タンパク質の核内への輸送がみられる条件下で細胞を固定し、間接蛍光抗体法を用いてhsc70の細胞内局在を調べたところ、核タンパク質と同様に核内に局在していた。このことからhsc70が核タンパク質と挙動を共にすることによって核タンパク質輸送に関与していることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Yoshihiro Yoneda: "A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently" Experimental Cell Research. 201. 313-320 (1992)
• [文献書誌] Naoko Imamoto: "Antibodies against 70-kD heat shock cognate protein inhibit mediated nuclear import of karyophilic proteins" J.Cell Biology. 119. 1047-1061 (1992)
• [文献書誌] Yumiko Okuno: "70kD heat shock cognate protein colocalizes with karyophilic proteins into the nucleus during their transport in vitro" Experimental Cell Research.
• [文献書誌] 米田 悦啓: "タンパク質の核内移行とリン酸化" 生体の科学. 43. 277-280 (1992)
• [文献書誌] 米田 悦啓: "核タンパク質の核内移行のメカニズム[III]" ブレインサイエンス. 3. 271-273 (1992)
• [文献書誌] 米田 悦啓: "核タンパク質の核内移行のメカニズム[IV]" ブレインサイエンス. 3. 413-415 (1992)
• [文献書誌] Yoshihiro Yoneda: "Methods in Enzymology" Academic Press,Inc.,
• [文献書誌] 栗原 敏修: "Annual Review細胞生物学1992" 中外医学社, 13 (1992)