化骨形成モデルを用いた老化による骨形成能低下機序の解明

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 04836022
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 土肥 祥子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教授 (50155628)
• 研究分担者: 田端 司郎 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (40041652) ; 大串 始 奈良県立医科大学, 医学部, 助手 (80213669)
• キーワード: 老化 / 骨髄細胞 / 骨芽細胞 / 骨形成能 / ビタミンK / 分化

研究概要

平成4年、5年度のin vivo骨形成モデルを用いた実験結果より、骨粗しょう症の病態の成因として細胞の老化即ち骨芽細胞の活性低下、未分化細胞の骨芽細胞への分化能の低下が示唆された。本年度はin vitroの骨形成モデル実験を実施し、エイジングによる骨形成能低下を骨代謝指標蛋白質の遺伝子発現量を測定することにより検討した。また骨形成能の低下に対するビタミンK,Dの効果についても検討した。
8週齢と24週齢ラット骨髄をMEM培地で前培養し、細胞数10×10^3 cells/dishで培地MEM、10% FCS中Dexamethasone,Ascorbic acid-phosphate,β-glycerophosphateの存在下で2週間培養した。対照群、ビタミンK添加群に分け2週後細胞のDNA量と骨芽細胞の指標であるアルカリフォスファターゼ(ALP)活性値を測定すると8週齢のラット骨髄培養細胞による骨形成は老化により低下することが示唆された。ビタミンK添加により骨髄細胞から骨芽細胞への分化を促進する傾向にあった。また培養2週間後RNAを抽出しNorthern blot解析により骨芽細胞への分化能を調べたところ骨芽細胞に特異的なオステオカルシン(BGP)mRNAの発現量にはほとんど差はなかった。
培養2週後ミネラルの沈着したnoduleの細胞層を集め4%パラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋した。このパラフィン切片についてのDigoxygenin(DIG)標識アンチセンスRNAプローブでのin situハイブリダイゼーション像はnodule周辺の立方形の骨芽細胞のみがBGP mRNAを発現していることを示した。