|
我々が開発した「光アフィニティーラベル化後修飾法(P-PALM)」は、タンパク質の活性中心近傍に部位特異的に非天然分子を導入可能なタグを挿入可能な手法である。創めにその有用性を試した糖結合性タンパク質(レクチン)の一種であるコンカナバリンA(Con A)では、様々な人工分子を導入することで、目的の機能を付与した蛍光性バイオセンサーへと機能変換することに成功している。
一方で、我々がP-PALMで用いたチオール化学とは直交性(orthogonality)を有する導入法も多く知られている。これらの導入法とP-PALMとを組み合わせることで、それぞれ単独では達成できない高機能の付与が期待できると考え、本年度はその実現に着手した。
まず、その有用性を示す為に、古典的な化学修飾法として知られるアミノ基選択的修飾法を選択し、本来アミノ基に対するランダムな修飾がおこる本手法を、部位選択的に進行させる条件の最適化をおこなった。
次に、最適化されたアミノ基修飾法とP-PALMを組み合わせることで、タンパク質-分子上に蛍光色素を二重修飾したCon A (AMCA-Fl-Con A)の調整に成功した。その機能評価をおこなった結果、Con Aの糖結合挙動をレシオメトリーで検出可能な蛍光性糖質バイオセンサーへと機能変換できたことを確認した。また、その特性を生かした様々な応用を検討し、糖切断酵素の反応追跡・細胞内・外における糖質のイメージングなどをおこなうことに成功した。これらの応用例は、従来の一分子の蛍光色素修飾では達成困難であり、本系のようにorthogonalityを有するタンパク質修飾法を併用することで初めて達成できる。本系はその有用性を示した先駆的な研究である。
|
