|
ミオシンVは、その2つのモータードメインが交互にATPを加水分解し、協調した働きをすることでアクチン線維上を数μmに渡り連続的に運動するというモデルが提唱されている。本研究は、このミオシンVの変異体を1分子観察することにより、モータードメイン間に形成される協調した働きを直接観察する手法を開発し、その仕組みの解明を目的として研究を行った。
本年度の年次計画においては、ミオシンVのATP加水分解へ影響を与える変異体を作り、その機能を特定する予定であった。しかし、近年他グループによりミオシンVのヌクレオチド結合型X線結合構造が解かれたが、まだその構造データが公表されていないことから、変異体作成についてはその報告を待ちながら設計を行いつつ、同時に1分子観察のための顕微鏡装置開発を行った。
まず、野生型のミオシンVにおいてATPの結合解離と運動機能の関係を明らかにするために、それらの同時計測を可能にする顕微鏡装置の設計を行った。そして、蛍光性Arpの1分子観察を可能にする1分子蛍光顕微鏡と、力学的な運動測定を可能にする光ピンセット装置、および運動のナノ計測を可能にする4分割フォトダイオードを用いたナノメトリー装置を1台の顕微鏡に組み込むことに成功した。またそれらの装置を制御し、統合的に計測結果を取り込むためのソフトウエア開発も行った。
その結果、観察対象をナノメートルの精度で運動計測することを可能にした。また、新たに開発した1分子蛍光観察顕微鏡装置を用いて、ミオシンVへのATP結合解離のイベントを、蛍光性ATPを用いて可視化することを可能にした。
|
