| 研究概要 |
グラム陰性細菌感染症に起因するエンドトキシンショックは生命を脅かす非常に重篤な症状であり,その治療薬の開発が待望されている。この症状を引き起こす原因物質であるリポ多糖を認識して,過剰な免疫応答を惹起する自然免疫系の蛋白質としてMD-2とTLR4受容体が同定されているが,リポ多糖認識およびシグナル伝達の分子機構は明らかになっていない。研究代表者は,MD-2およびTLR4蛋白質がリポ多糖を認識して免疫応答を引き起こす機構を三次元構造から明らかにするため,X線結晶構造解析に向けてこれらの蛋白質の大量発現系の構築、精製、性状解析、結晶化を進めてきた。
ヒトMD-2については,結晶化に適した高純度の蛋白質試料を得ることができた。蒸気拡散平衡法による結晶化条件のスクリーニングの結果,ポリエチレングリコールを沈殿剤としてヒトMD-2単体の結晶を得ることができた。実験室でのX線回折像測定の結果,この結晶は正方晶系に属し,3.0Å程度の反射を与えることがわかった。また斜方晶系のLipid IVa複合体結晶も得ることができた。
TLR4蛋白質については,ヒトTLR4およびマウスTLR4の細胞外ドメインの遺伝子を組み込んだベクターを作成し,酵母P.Pastorisに導入して発現を試みたが培養液上清に目的蛋白質を得ることができなかった。そこで原因を明らかにするために,N末端およびC末端にタグを付加した,異なる長さのC末端の欠損体を複数作成し,発現を試みた。その結果,ヒトTLR4のN末端3分の1までの発現が確認できた。
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