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非相同的組換え(NHEJ)経路の異常を介する挿入型変異の機構を解明するために、ポリ(ADP-リボース)合成酵素(Parp-1)欠損細胞の細胞系及び細胞粗抽出液系を用いて、種々のDNA傷害後の二本鎖DNA切断とその修復効率、変異について解析を行っている。Parp-1は塩基除去修復(BER)系の重要な構成因子である。Parp-1欠損によるBERの停滞から二本鎖DNA切断、そしてNHEJ経路への乗り換え、欠失/挿入型変異について調べ、NHEJ/BERの異常と欠失/挿入/転位型変異の関連性を明らかにしようと試みている。
Parp-1のNHEJ型修復への関与を検討するため、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドpRLをRarp-1欠損マウス胎仔線維芽細胞(MEF)に導入して細胞レベルでend joining (EJ) assayを行った。その結果、正確及び不正確を含むEJ型修復効率はParp-1^<-/->とParp-1^<+/+>MEFにおいて有意差は認められなかった。従って、Parp-1欠損は二本鎖DNA切断を有するDNAを基質としたEJ型修復の効率及びエラー頻度に影響を与えないと考えられる。次に、アルキル化剤処理後のBER系からDNA切断を介してのNHEJ経路への移行の可能性を調べるため、パルスフィールドゲル電気泳動を用い、Parp-1欠損MEFをメチルメタンスルホン酸処理後、DNA切断量の変化を検討した。Parp-1^<-/->MEFにおいてParp-1^<+/+>MEFと比較し、一本鎖DNA切断だけではなく二本鎖DNA切断量の上昇が認められた。また、二本鎖DNA切断修復におけるDNA-dependent protein kinase (DNA-PK)及びParp-1の相互作用を検討するため、DNA-PK及びParp-1両遺伝子変異を有する自然不死化MEFを各々樹立した。現在、DNA-PK遺伝子変異のみを有するMEFを作製中であり、今後はNHEJ効率及び変異スペクトルを解析することによって、DNA-PKとParp-1の相互作用を明らかにする。
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