熱耐性RecA蛋白質を用いた組換えの分子機構の研究

1994 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 05044132
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小川 英行 大阪大学, 理学部, 教授 (70028207)
• 研究分担者: YURI V.Kil ペテルスブルグ 核物理学研究所, 分子放射線生物学部門・分子遺伝学研究室, 研究員 ; ALEXSEEV And ペテルスブルグ 核物理学研究所, 分子遺伝学部門, 研究員 ; LANZOV Vladi ペテルスブルグ 核物理学研究所, 分子遺伝学部門, 部長 ; 倉光 成紀 大阪大学, 理学部, 教授 (60153368) ; 伊藤 建夫 大阪大学, 理学部, 助教授 (40051817) ; 小川 智子 大阪大学, 理学部, 講師 (80028208) ; LANZOV Vladislav a. St.Petersburg Nuclear Physics Institute in Russia ; KIL Yuri v. St.Petersburg Nuclear Physics Institute in Russia
• 研究期間 (年度): 1993 – 1994
• キーワード: ロシア / サンクトペテルブルグ 原子核物理学研究所 / 大腸菌RecA蛋白質の構造と機能 / 好熱性菌recA遺伝子のクローニング / 温度感受性recA2278-5変異 / RecAのα-ヘリックスHの変異 / 好熱性菌のコドン使用頻度 / ATP結合蛋白質の共通アミノ酸配列

研究概要

遺伝子組換えの研究は常に新しく捉え直され、いつの時代でも遺伝学の中心的な研究となったきた。我々がおこなったRecA蛋白質の精製とその活性の発見によって、広範な生物種からRecA様の活性を持つ蛋白質の精製が可能となり、その分子機構を解明する気運が高まっている。その中で、RecA蛋白質の構造変化と機能との関連を明かにすることが焦眉の研究テーマである。我々は構造と機能の研究に有用な各種の変異recA変異を持つ、ロシアのサンクトペテルブルグ原子核物理学研究所、ランゾフ博士の研究室と協力して、それらの変異遺伝子が作る変異蛋白質の構造と機能を解析することによって、研究テーマの解析を格段に進歩させることを計画した。また、蛋白質の構造を解析するためには、物理化学的な測定が欠かせないが、その測定に適した熱に安定なRecA蛋白質が得られていないことが研究を困難にしている。熱安定蛋白質を得る有力な材料は高熱菌であるが、ロシアのランゾフ博士が、多種類の好熱菌を1982年以来、国後、択捉両島の温泉から収集している。その中から共同研究によって最も適した材料を選択するのがもう一つの共同研究の目的である。
この研究計画を実行するために、相互に訪問して両地で実験を行う計画を立てたが、ロシアの研究所の研究環境が、日に日に悪化しつつあることが明かになったので、実験材料を多量に使用する実験はできるだけ日本で行うのが、合理的であるという判断から初年度(1993年)は、Lanzov博士、Zlatina博士、Kaboev博士、Alexseev博士を招聘した。そして全体計画の検討と共に、RecA蛋白質の構造の面で全く未知の問題を明かにする可能性のある、温度感受性のRecA2278-5変異蛋白質をまず選び、その解析を開始した。又耐熱性菌の選択と選択した菌からのrecA遺伝子のクローニングも開始した。今年度は、我々がロシアに赴きロシアの研究所での本プロジェクトの推進の為に助言を行った。又Lanzov博士、Alexseev博士、Kil博士が我々の研究室に来て、初年度に開始した研究テーマで引き続き研究を行った。そして次のような成果を得た。
RecA2278-5変異蛋白質は、C末端のドメインのα-ヘリックスにあるGly278がThrにVal275がPheに置換したもので、温度感受性の性質を持つ。このα-ヘリックスがどのような機能に関与しているかは諸説が有り、大変興味がもたれていた。この変異蛋白質を持つ菌は高温で組換え欠損とSOS修復ができない。しかしこの蛋白質は試験管の中では、一本鎖及び二本鎖DNAへの結合能も高塩濃度下での重合能も、あらかじめ蛋白質単独で高温で加熱をしなければ、温度感受性の性質がでないことがわかった。即ちリガンドと相互作用することによって、構造が安定化する新しいタイプの変異であることが明かになった。得られた研究成果を総合することによって、この変異のあるα-ヘリックスの安定性は、組み換えとSOS修復に必ず必要な、RecA-ATP-ssDNAの複合螺旋構造体の形成に、最も必要であることが明かになった。
耐熱性菌のrecA遺伝子のクローニングは、これまでにクローニングされている十数個の細菌のRecA蛋白質で最も保存されているアミノ酸配列の部分(ATP結合部位)を参考に、さらに好熱細菌の各コドン使用頻度を加味して、塩基配列をデザインしてそれをプローブとした。そのプローブDNAをプラーマ-に用い、好熱細菌のDNAを鋳型として、PCR法によってクローニングに成功した。その遺伝子の塩基配列の決定がおこなわれ、現在遺伝子の約1/3長の配列が決まっている。塩基配列の著しい特徴は、コドンの第3番目の塩基は殆どがG或はCで、DNA構造を安定化するのに有利なコドンが使用されていることがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Ryuichi Kato and Hideyuki Ogawa: "An essential gene,ESR1,is required for mitotic cell growth,DNA repair and meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae" Nucleic Acids Research. 22. 3104-3112 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Katsyki Johzuka and Hideyiki Ogawa: "Interaction of Mre11 and Rad5-:Two protein required for DNA repair and meiosis-specific double-strand break formation in Saccharomyces cerevisiae" Genetics. 139(in press). (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hideyuki Ogawa,Katsuki Johzuka,Takuro Nakagawa,Sunhee,Leem and A.H.Hagiwara: "Functions of the yeast meiotic recombination genes,MRE11 and MRE2" Adv.Biophysics. 31. 67-76 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hitoshi Kurumizawa,Shukuko Ikawa,Tomoatsu Ikeya,Tomoko Ogawa and Takehiko Shibata: "A chimera RecA protein exhibits altered double-stranded DNA-binding." J.Biol.Chem.269. 3068-3075 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tomoko Ogawa,Akira Shinohara,Akira Nabetani,Tomoatsu Ikeya,Xiong Yu,Edward H.Egelman and Hideyuki Ogawa: "RecA-like Recombination Proteins in Eukaryotes:Functions and Structures of RAD51 Genes." Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.58. 567-576 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hitoshi Kurumizaka,B.J.Rao,Tomoko Ogawa,Charles M.Radding and Takehiko Shibata,: "A Chimeric RecA protein that implicates non-Watson-Crick interaction in homologous pairing" Nucleic Acid Res.22. 3387-3391 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tomoko Ogawa Akira Shinohara and Tomoatsu Ikeya: "A species-specific interaction of Rad51 and Rad52 proteins" Adv.Biophysics.31. 93-100 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masahiro Terasawa,Akira Shinohara,Yasuo Hotta,Hideyuki Ogawa,and Tomoko Ogawa: "Localization of RecA-like Recombination Proteins on Chromosomes of Lily at Various Meiotic Stages." Genes & Development. (in press). (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kil'Yu.V.,Goryshin I.Yu.,Lantsov V.A: "Recombinational mechanism of IS50 mobile element precise excision in Escherichia coli K12 cells" Molecular Biology. 23. 373-379 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Lantsov V.A.: "Ideal gene therapy:approaches and horizons" Molecular Biology. 28. 321-327 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Namsaraev E.A.,Akhmedov A.T.,Lantsov V.A.: "Two types of DNA-pairing enzymic activities in rat spermatocyte nuclei partial purification and characterization" Molecular Biology. 28. 499-502 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Benjukh D.N.,Silbergleit Arc.S.,Chepurin I.V.,Ponomarenko M.P.,Kolchanov N.A.and V.A.Lanzov.: "Structure-function relationship in bacterial RecA protein:computer analysis of the primary structure of RecA protein family" N.A.Kolchanov and H.A.Lim(eds.),In Computer analysis of genetic macromolecules:structure,function and evolution.World Scientific Pub.Co.,Singapore. 469-477 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Zaitsev E.,Alexseyev A.,Lanzov V.,Satin L.,Clark J.A.: "Nucleotide sequence between reca and alaSp in E.coli K12 and the sequence change in four recA mutations" Mutation Research.323. 173-177 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kil Yu.V.,Goryshin I.Yu.,Lanzov V.A: "Transmids:particularities of transposition,application for direct DNA sequencing of conjugative plasmid" Dokl.Acad.Sci.Russia. 335. 251-254 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kil Yu.V.,Goryshin I.Yu.,Lanzov V.A.: "Nature of integration specificity for IS50 mobile element in Escherichia coli" Doki.Acad.Sci.Russia.339. 705-709 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Matsushima,Y.,Kim,D.-W.,Yoshimura,T.,Kagamiyama,H.Esaki,N.,and Kuramitsu,S.: "Replacement of Active Site Lysine-239 of Thermost-able Aspartate Amino-transferase by S-(2-Aminoethyl)Cysteine:Properties of the Mutant Enzyme" J.Biochem.115. 108-112 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Miyazawa,K.,Kawaguchi,S.,Okamoto,A.,Kato,R.,Ogawa,T.,and Kuramitsu,S: "Construction of Aminotransferase Chimeras and Analysis of Their Substrate □ Specificity" J.Biochem. 115. 568-577 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Okamoto,A.,Higuchi,T.,Hirotsu,K.,Kuramitsu,S.,and Kagamiyama,H.: "X-Ray Crystallographic Study of Pyridoxal 5'-Phosphate-Type Aspartate Aminotransferase from Escherichia coli in Open and Closed Forms" J.Biochem. 116. 95-107 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Watanabe,R.,Masui,R.,Kato,R.,and Kuramitsu,S: "Interaction of Escherichia coli RecA Protein with ATP and Its Analogues" J.Biochem. 116. 960-966 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kawaguchi,S.and Kuramitsu,S.□: "Homologus Ligation" Trends Genet.10. 420 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Metzler,D.E.,Metzier,C.M.,Scott,R.D.,Mollova,E.T.,Kagamiyama,H.,Yano,T.,Kuramitsu,S.,Hayashi,H.,Hirotsu,K.,and Miyahara,I.: "NMR Studies of 1H Resonances in the 10-18-ppm Range for Aspartate Aminotransferase from Escherichia coli" □ J.Biol.Chem.269. 28027-28033 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kawaguchi,S.and Kuramitsu,S.□: "Separation of Heat-Stable Proteins from Thermus thermophilus HB8 by Two-Dimensional Electrophoresis" Electophoresis. (in press). (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Mikawa,T.,Masui,R.,Ogawa,T.,Ogawa,H.,and Kuramitsu,S.(1995) □: "N-Terminal 33 Amino Acid Residues of Escherichia coli RecA Protein Contribute to Its Self-Assembly" J.Mol.Biol.(in press). (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 小川智子 篠原 彰 小川英行: "真核生物の組換え蛋白質Rad51とRad52の機能と構造" 実験医学(羊土社)「トッピクス」. 12. 524-547 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 小川英行、小川智子: "酵母に観る最新の真核生物像 VI.組換え機構 減数分裂期組換え-関与する遺伝子とその普遍性-" 蛋白質 核酸 酵素(共立出版)「臨時増刊号」. 39. 568-578 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 篠原 彰 小川英行 小川智子: "真核生物の組換え(修復)に働く遺伝子" 細胞工学 (秀潤社). 13. 710-719 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 小川智子: "真核生物の組換え蛋白質の機能と構造" 第25回 放射性総合医学研究所シンポジウム. 25. 25-37 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 篠原 彰 小川英行 小川智子: "真核生物RAD51遺伝子の構造と機能" 日本臨床 (日本臨床社). 53. 239-249 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 河口真一,倉光成紀: "酵素反応のダイナミックス" 蛋白質 核酸 酵素. 39. 1083-1090 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ryuichi Kato and Hideyuki Ogawa: "Nucleic Acid Res." An essential gene, ESR1, is required for mitotic cell growth, DNA repair and meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. 22. 3104-3112 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Katsyki Johzuka and Hideyuki Ogawa: "Interaction of Mre11 and Rad5- : Two protein required for DNA repair and meiosis-specific double-strand break formation in Saccharomyces cerevisiae" Genetics. 139. Inpress (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hideyuki Ogawa, Katsuki Johzuka, Takuro Nakagawa, Sun hee, Leem and A.H.Hagiwara: "Functions of the yeast meiotic recombination genes, MRE11 and MRE2" Adv.Biophysics. 31. 67-76 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hitoshi Kurumizaka, Shukuko Ikawa, Tomoatsu Ikeya, Tomoko Ogawa and Takehiko Shibata: "A chimera RecA protein exhibits altered double-stranded DNA-binding" J.Biol.Chem. 269. 3068-3079 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tomoko Ogawa, Akira Shinohara, Akira Nabetani, Tomoatsu Ikeya, Xiong Yu, Edward H.Egelman and Hideyuki Ogawa: "RecA-like Recombination Proteins in Eukaryotes : Functions and Structures of RAD51 Genes" Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 58. 567-576 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hitoshi Kurumizaki, B.J.Rao, Tomoko Ogawa, Charles M.Radding and Takehiko Shibata: "A chimeric RecA protein that implicates non-Watson-Crick interaction in homologous pairing" Nucleic Acid Res.22. 3387-3391 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tomoko Ogawa Akira Shinohara and Tomoatsu Ikeya: "A species-specific interaction of Rad51 and Rad52 proteins" Adv.Biophysics. 31. 93-100 (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masahiro Terasawa, Akira Shinohara, Yasuo Hotta, Hideyuki Ogawa and Tomoko Ogawa.: "Localization of RecA-like Recombination proteins on Chromosomes of Lily at Vanious Meiotic Stages" Genes & Development. inpress (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kil'Yu.V., Goryshin I.Yu., Lantsov V.A: "Recombinational mechanism of IS50 mobile element precise excision in Escherichia coli K12 cells" Molecular Biology. 28. 373-379 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Lantsov V.A: "Ideal gene therapy : approaches and horizons" Molecular Biology. 28. 321-327 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Namsaraev E.A., Akhmedov A.T., Lantsov V.A: "Two types of DNA-pairing enzymic activities in rat spermatocyte nuclei : partial punification and characterization" Molecular Biology. 28. 499-502 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Benjukh D.N., Silbergleit Arc.S., Chepurin I.V., Ponomarenko M.P., Kolchanov N.A.and V.A.Lanzov: "Structure-function relationship in bacterial RecA protein : computer analysis of the primary structure of RecA protein family" N.A.Kolchanov and H.A.Lim(eds.), Computer analysis of genetic macromolecules : structure, function and evolution.World Scientific Pub.Co., Singapore. 469-477 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Zaitsev E., Alexseyev A., Lanzov V., Satin L., Clark J.A: "Nucleotide sequence between reca and alaSp in E.coli K12 and the sequence change in four recA mutations" Mutation Research.1994.323. 173-177 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kil Yu.V., Goryshin I.Yu., Lanzov V.A.: "Transmids : particularities of transposition, application for direct DNA sequencing of conjugative plasmid" Dokl.Acad.Sci.Russia.1994.335(2) : 251-254.335. 251-254 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kil Yu.V., Goryshin I.Yu., Lanzov V.A.: "Nature of integration specificity for IS50 mobile element in Escherichia coli" Dokl.Acad.Sci.Russia.1994.339(5) : 705-709. 339. 705-709 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Matsushima, Y., Kim, D.-W., Yoshimura, T., Kuramitsu, S., Kagamiyama, H., and Esaki, N.: "Replacement of Active Site Lysine-239 of Thermostable Aspartate Aminotransferase by S-(2-Aminoethyl)Cysteine : Properties of the Mutant Enzyme" J.Biochem.115. 108-112 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Miyazawa, K., Kawaguchi, S., Okamoto, A., Kato, R., Ogawa, T., and Kuramitsu, S.: "Construction of Aminotransferase Chimeras and Analysis of Their Substrate Specificity" J.Biochem.115. 568-577 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Watanabe, R., Masui, R., Kato, R., and Kuramitsu, S: "Interaction of Escherichia coli RecA Protein with ATP and Its Analogues" J.Biochem.116. 960-966 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Okamoto, A., Higuchi, T., Hirotsu, K., Kuramitsu, S., and Kagamiyama, H.: "X-Ray Crystallographic Study of Pyridoxal 5'-Phosphate-Type Aspartate Amino transferase from Escherichia coli in Open and Closed Forms" J.Biochem.116. 95-107 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawaguchi, S.and Kuramitsu, S.: "Homologus Ligation" Trends Genet.10. 420 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Metzler, D.E., Metzler, C.M., Scott, R.D., Mollova, E.T., Kagamiyama, H., Yano, T., Kuramitsu.S., Hayashi, H., Hirotsu, K., and Miyahara, I.: "NMR Studies of 1H Resonances in the 10-18-ppm Range for Aspartate Amino transferase from Escherichia coli" J,Biol.Chem.269. 28027-28033 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kawaguchi, S.and Kuramitsu.S: "Separation of Heat-Stable Proteins from Thermus thermophilus HB8 by Two-Dimensional Electrophoresis" Electophoresis. inpress (1995)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tsutomu Mikawa, Ryoji Masui, Tomoko Ogawa, Hideyuki Ogawa and Seiki Kuramitsu: "N-terminal 33 amino acid residues of Escherichia coli RecA protein contribute to its self-assembly" J.Mol.Biol.Submitted.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より