新規微生物酵素フェニルアラニン脱水素酵素の構造、機能および応用に関する研究

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05044138
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 助教授 (00222589)
• 研究分担者: 加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助手 (20254237) ; クーパー アーサー.J. 米国コーネル大学, 医学部・生化学科, 教授
• キーワード: Amino Acid / Immunotitration / Amino Acid Dehydrogenase / Primary Structure / Enzyme Purification / Phenylalanine Dehydrogenase / Screening / Sequence Homology

研究概要

フェニルアラニン脱水素酵素産生菌として、土壌中よりスクリーニングされたBacillus spaericus及びSporosarcina ureae由来のフェニルアラニン脱水素酵素を、本酵素遺伝子を有する組み換え大腸菌より数十mg単位で高度に精製した。また、Sporosarcina ureae野性株より本酵素を高度に精製した。
フェニルアラニン脱水素酵素産生菌として、保存菌株中よりスクリーニングされたBacillus badiusの無細胞抽出液よりフェニルアラニン脱水素酵素を結晶状に単離した。酵素標品をリジルエンドペプチダーゼで分解後、得られた部分的ペプチド断片をHPLCで分取し、プロテインシーケンサーを用いて酵素内部のアミノ酸配列を決定した。すでに全一次構造の明らかになっているBacillus sphaericus由来のフェニルアラニン脱水素酵素の配列と比較検討を行ったところ、両酵素間で優位なホモロジーが確認された。Bacillus sphaericusの本酵素遺伝子配列を参考にして、Bacillus badiusの塩基配列決定用のDNAプローブを合成した。
結晶状に精製したBacillus spaericus由来のフェニルアラニン脱水素酵素を用いてポリクロナール抗体を作成した。本抗体を用いて、他の菌株由来のフェニルアラニン脱水素酵素との免疫交差反応を行ったところ、Sporosarcina ureae由来の酵素のみならず、Bacillus spaericusと同属であるBacillus badius由来の酵素とも免疫反応は陰性であった。

研究成果

• [文献書誌] M.Ueda: "Purification and Chracterization of Maleate Hydratase from Arthrobacter sp.strain MCI2612" Bioscience Biotechnology Biochemistry. 57. 1545-1548 (1993)
• [文献書誌] Y.Asano: "Occurrence of 3-Methylaspartate ammonia-lyase in Facultative Anaerobes and Their Application to Synthesis of 3-Substituted(S)-Aspartic Acids." Bioscience Biotechnology Biochemistry. 58. 223-224 (1994)
• [文献書誌] M.Ueda: "Production of S-(+)-Citramalate from Itaconateby Resting Cells of Alcaligenes denitrificans strain MCI2775" Applied Microbiology and Biotechnology. 40. 466-469 (1993)
• [文献書誌] Y.Asano: "Microbial Production of Theobromine from Caffeine" Bioscience Biotechnology Biochemistry. 57. 1286-1289 (1993)
• [文献書誌] Y.Asano: "Microbial Production of D-Malate from Maleate" Applied and Environmental Microbiology. 59. 1110-1113 (1993)
• [文献書誌] Y.Kato: "Enzymatic Synthesis of L-β-chloroalanine Using Amino Acid Dehydrogenase" Applied Microbiology and Biotechnology. 39. 301-304 (1993)
• [文献書誌] A.J.L.Cooper: "Enzymology of cysteine S-conjugate beta-lyases" Advances in Pharmacology. 27. 73-115 (1994)
• [文献書誌] A.J.L.Cooper: "High activities of glutamine transaminase K(dichloro vinylcysteine beta-lyase)and omega-amidase in the choroid plexus of rat brain" Journal of Neurochemistry. 61. 1731-1751 (1993)
• [文献書誌] A.J.L.Cooper: "Ammonia metabolism in mammals:Interorgan relationships." Adv.Exp.Biol.Med.341. 21-37 (1993)
• [文献書誌] T.K.Makar: "Vitamin E,glutathione,glutathione disulfide and enzymes of glutathione metabolism in cultures of chick astrocytes and neurons:Evidence that astrocytes play an important role in antioxidative processes in the brain." Journal of Neurochemistry. 62. 45-53 (1994)
• [文献書誌] T.K.Makar: "Glutamine transaminase K and omega-amidase in primary cultures of astrocytes and neurons and in embryonic chick forebrain.Marked induction of brain glutamine transaminase K at time of hatching." Journal of Neurochemistry. 62. 1983-1988 (1994)
• [文献書誌] Y.Asano: "A New Enzyme D-Aminopeptidase:Structure,Function and Application to Organic Synthesis in Frontiers and New Horizons in Amino Acid Research" Elsevier, (1992)
• [文献書誌] A.J.L.Cooper: "Glutathione in the brain;disorders of glutathione metabolism.In:The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease" Butterworth-Heinemman,Boston,Massachusetts, (1993)
• [文献書誌] Q.R.Smith: "Amino acid transport in brain.In:Mammalian Amino Acid Transport:Mechanism and Control" Plenum Press,New York, (1993)
• [文献書誌] W.A.Pulsinelli: "Metabolic encephalopathies and coma.,In:Basic Neurochemistry:Molecular,Cellular and Medical Aspects,5th Edition" Raven Press,New York, (1994)