ステロイド代謝を触媒するチトクロームP-450とその関連酵素の構造-活性相関

1994 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 05044176
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 大村 恒雄 九州大学, 大学院医学系研究科, 名誉教授 (80029933)
• 研究分担者: CHERNOGOLOV アレクロイ エー. ベラルーシ科学アカデミー, 生物有機化学研究所, 研究員 ; USANOV Serge ベラルーシ科学アカデミー, 生物有機化学研究所, 教授 ; 根岸 正彦 米国国立環境衛生研究所, 研究員 ; 三原 勝芳 九州大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (40029963) ; 原 孝之 中村学園大学, 家政学部, 助教授 (10164998) ; CHERNOGOLOV Alexey a. Academy of Sciences of Belarus, Institute of Bioorganic Chemistry, Research Asso
• 研究期間 (年度): 1993 – 1994
• キーワード: ステロイドホルモン / チトクロームP-450 / P-450scc / アドレノドキシン

研究概要

動物臓器においてのステロイド代謝にはミクロソーム及びミトコンドリアに存在する数種類のチトクロームP450が関与している。本研究はこれら一群のP450によるステロイド代謝反応の活性調節機構の解明を目的とし、研究代表者を中心とする日本の研究グループと米国の根岸博士の研究グループ、及びベラル-シ共和国のUsanov博士の研究グループの共同研究を行なった。研究の重点はミトコンドリア型P450に置き、ステロイド代謝反応を触媒するP450とその還元酵素の構造-活性相関を研究した。研究を推進するためUsanov博士とChernogolov博士が来日し、原が根岸博士の研究室とUsanov博士の研究室を訪問して共同研究を行なった。平成5年〜平成6年の研究実績を下記する。
1.ミクロソーム型p450については生合成時のP450の膜への組み込みと高次構造形成について研究を進め、膜への組み込みを決定するシグナルアンカー配列のアミノ末端が小胞体の内腔に露出していることをP450aromについて証明してシグナルアンカー配列の膜内配向を決定し、シグナルアンカー配列に続くプロリンに富む短かなアミノ酸配列が膜に組み込まれたP450分子の高次構造形成に必須なことを確かめた(大村、三原)。
2.ステロイドホルモン生合成に関与するP450の臓器特異的発現を研究し、P450遺伝子の発現を支配する転写因子Ad4BPを確認し、培養細胞系を用いる実験によりAd4BPがステロイドホルモンの生合成に関与する一群のP450の発現を調節していることを証明した(大村)。
3.ステロイドを代謝する活性をもつマウス肝臓のミクロソーム型P450について、P450分子内の特定のアミノ酸の変異によって触媒する反応の基質特異性が大幅に変化することを確かめ、活性中心においてのステロイド分子の結合様式を検討した(根岸)。
4.ミトコンドリア内膜のP450sccについて膜内トポロジーを部位特異性抗体の結合によって解析し、P450分子の大部分がマトリックス側の膜面上に露出していることを確かめた。また、マトリックス側に露出している部分がプロテアーゼの限定分解によって切断される2つの大きなドメインから成ることを見出し、切断点を決定した(Usanov)。
5.アドレノドキシン(AD)からミトコンドリア型P450への還元力供給反応を解析するため、ADとその前駆体(pAD)のcDNAを効率よく大腸菌で発現させ、発現したADおよびpADを均一にまで精製する方法を確立した。cDNAの改変によりアミノ酸配列の改変を行なったADも作成され、ADとP450sccの反応研究に使用された。精製されたpADは鉄-硫黄活性中心をもつホロ型であり、ADと同様にP450sccとチトクロームcを還元する活性をもっていた。pADとADの還元活性ではVmaxやKmは異なっていたが、pADがADと同じ活性を示すことは、pADの成熟型蛋白質部分が延長ペプチド部分とは独立した高次構造を形成できることを示していると考えられる(Chernogolov、原、三原)。
6.ADとP450scc間での電子伝達反応機構を明らかにするため、AD分子とP450scc分子の結合部位の検討を進めた。種々の化学架橋試薬を用いてADとP450sccの複合体においてAD分子とP450scc分子間の架橋と、分子内の架橋部位のアミノ酸配列の決定を行なっている。架橋複合体を精製する方法は確立できたが、架橋部位についてはまだ最終結論を得るに至っていない。^<14>Cで標識したADを用いた研究もUsanov博士の研究室で行なわれている(原、Usanov)。
7.副腎皮質ミトコンドリアについて外から加えたNADPHによるP450の還元を測定し、ジギトニン処理で外膜を除いたミトプラストでは還元速度が大幅に低下することを見出した。ミトコンドリア外膜にNADPHの還元力をミトコンドリア内に伝達する活性が存在する可能性が考えられるので検討中である(原)。

研究成果

• [文献書誌] Shin-ichirou Honda: "Ad4BP regulating steroidogenic P-450 gene is a member of steroid hormone receptor superfamily." J.Biol.Chem.268. 7494-7502 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ken-ichirou Morohashi: "Activation of CYP11B gene promoters by the steroidogenic cell-specific transcription factor,Ad4BP." Mol.Endocrinol.7. 1196-1204 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masatoshi Nomura: "Three forms of rat CYP11B genes:11B-hydroxylase gene,aldosterone synthase gene,and a novel gene." J.Biochem.113. 144-152 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Soh Yamazaki: "Importance of the proline-rich region following signal-anchor sequence in the formation of correct conformation of microsomal cytochrome P-450s." J.Biochem.114. 652-657 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Okura Shimozawa: "Core glycosylation of cytochrome P-450(arom).Evidence for localization of N terminus of microsomal cytochrome P-450s in the Lumen." J.Biol.Chem.268. 21399-21402 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kazuya Murakami: "The transmembrane region of microsomal cytochrome P450 identified as the endoplasmic reticulum retention signal." J.Biochem.116. 164-175 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ken-ichirou Morohashi: "Functional difference between Ad4BP and ELP,and their distributions in steroidogenic tissues." Mol.Endocrinol.18. 643-653 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Osamu Hatano: "Sex-dependent expression of a transcription factor,Ad4BP,regulating steroidogenic P-450 genes in the gonads during prenatal and postnatal rat development." Development. 120. 2787-2797 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Takanori Yasukochi: "Putative functions of phenylalaine-350 of pseudomonas putida cytochrome P-450cam." Biochim.Biophys.Acta. 1204. 84-90 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kazuhide Nakamura: "Significant contribution of arginine-112 and its positive charge of pseudomonas putida cytochrome P-450CAM in the electron transport from putidaredoxin." Biochim.Biophys.Acta. 1207. 40-48 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yoshiyuki Sakai: "In-vitro evidence for the regulation of 17,20-lyase activity by cytochrome b_5 in adrenocortical adenomas from parients with cushing's syndrome." Clin.Endocrinol.40. 205-209 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yoshiyuki Sakai: "Mechanism of abnormal production of adrenal androgens in parients with adrenocortical adenomas and carcinomas." J.clin.Endocrinol.Metab.78. 36-40 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Iwasaki: "Inherent versatility of P450 oxygenase:conferring dehydroepiandrosterone hydroxylase activity to P450 2a-4 by a single amino acid mutation at position 117." J.Biol.Chem.269. 9079-9083 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] D.Schwarz: "Rotation of cytochrome P450scc(CYPllAl)in proteoliposomes studied by delayed fluorescence depolarization." Biochem.Biophys.Res.Cummuns.195. 889-896 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] A.A.Chernogolov: "Selective chemical modification of Cys^<264> with diiodofluorescein iodacetamide as a tool to study the membrane topology of cytochrome P450scc(CYPllAl)." FEBS Letters. 340. 83-88 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] A.A.Chernogolov: "Investigation of the membrane topolology of cytochrome P450scc." Futura. 9. 53-55 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masao Sakaguchi: "Frontiers in Biotransformation,Vol.8" Akademie Verlag, 253 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Tsuneo Omura: "Handbook of Experimental Pharmacology,Vol.105:Cytochrome P450" Springer-Verlag Berlin, 350 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shin-ichirou Honda: "Ad4BP regulating steroidogenic P-450 gene is a member of steroid hormone receptor superfamily." J.Biol.Chem.268. 7494-7502 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ken-ichirou Morohashi: "Activation of CYP11B gene promoters by the steroidogenic cell-specific transcription factor, Ad4BP." Mol.Endocrinol.7. 1196-1204 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masatoshi Nomura: "Three forms of rat CYP11B genes : 11B-hydroxylase gene, aldosterone synthase gene, and a novel gene." J.Biochem.113. 144-152 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Soh Yamazaki: "Importance of the proline-rich region following signal-anchor sequence in the formaion of correct conformation of microsomal cytochrome P-450s." J.Biochem.114. 652-657 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Okura Shimozawa: "Core glycosylation of cytochrome P-450 (arom). Evidence for localization of N terminus of microsomal cytochrome P-450s in the lumen." J.Biol.Chem.268. 21399-21402 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kazuya Murakami: "The transmembrane region of microsomal cytochrome P450 identified as the endoplasmic reticulum retention signal." J.Biochem.116. 164-175 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ken-ichirou Morohashi: "Functional difference between Ad4BP and ELP,and their distributions in steroidogenic tissues." Mol.Endocrinol.18. 643-653 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Osamu Hatano: "Sex-dependent expression of a transcription factor, Ad4BP,regulating steroidogenic P-450 genes in the gonads during prenatal and postnatal rat development." Development. 120. 2787-2797 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Takanori Yasukochi: "Putative functions of phenylalaine-350 if pseudomonas putida cytochrome P-450cam." Biochim.Biophys.Acta. 1204. 84-90 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kazuhide Nakamura: "Significant contribution of arginine-112 and its positive charge of pseudomonas putida cytochrome P-450CAM in the electron transport from putidaredoxin." Biochim.Biophys.Acta. 1207. 40-48 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshiyuki Sakai: "In-vitro evidence for the regulation of 17,20-lyase activity by cytochrome b_5 in adrenocortical adenomas from parients with cushing's syndrome." Clin.Endocrinol.40. 205-209 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoshiyuki Sakai: "Mechanism of abnormal production of adrenal androgens in parients with adrenocortical adenomas and carcinomas." J.Clin.Endocrinol.Metab.78. 36-40 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M.Iwasaki: "Inherent versatility of P450 oxygenase : conferring dehydroepiandrosterone hydroxylase activity to P450 2a-4 by a single amino acid mutation at position 117." J.Biol.Chem.269. 9079-9083 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] D.Schwarz: "Rotation of cytochrome P450scc (CYP11A1) in proteoliposomes studied by delayd fluorescence depolarization." Biochem.Biophys.Res.Cummuns. 195. 889-896 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] A.A.Chernogolov: "Selective chemical modification of Cys^<264> with diiodofluorescein iodacetamide as a tool to study the membrane topology of cytochrome P450scc(CYP11A1)." FEBS Letters. 340. 83-88 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] A.A.Chernogolov: "Invesitigation of the membrane topology of cytochrome P450scc." Futura. 9. 53-55 (1994)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masao Sakaguchi: Akademie Verlag. Frontiers in Biotransformation, Vol.8, 253 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tsuneo Omura: Springer-Verlag Berlin. Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.105 : Cytochrome P450, 350 (1993)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より