1993 年度実績報告書

核酸構造解析のための安定同位体標識多次元NMR法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	05101004
研究機関	大阪大学
研究代表者	京極好正大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90012632)
研究分担者	阿久津秀雄横浜国立大学, 工学部, 教授 (60029965) 甲斐荘正恒東京都立大学, 理学部, 教授 (20137029)
キーワード	安定同位体標識 / 多次元NMR / 核酸 / 動的構造 / プリンヌクレオシド醗酵法 / T7RNAポリメラーゼ / 2次元相関スペクトル / 固相合成
研究概要	本研究の目的は安定同位体標識した核酸に、多次元NMRを適用し、その静的、動的構造を構築する手法を開発することにある。そのためには安定同位体標識したDNA/RNAオリゴマーを合成する手法を確立することが重要な基盤となる。化学的な合成には固相合成機を用いる方法において大きな進展があった。(1)^<13>C-標識グルコースから有機化学的手法によりデオシキリボース誘導体を合成し、さらに非標識チミンと縮合させて糖部分のみを高度に^<13>C-標識したチミンジンを33%の収率で合成した。(2)98%^<13>C-、及び15%^<13>C-グルコース及び^<15>N-アンモニウム塩を原料とするプリンヌクレシド醗酵法により対糖15-20%程度の収率で標識したグアノシン/アデノシンを調製した。これらの内、アデノシンを好収率で2'-デオキシ化した。(3)標識したデオキシヌクレオシド類をアミダイト誘導体に好収率で変換し、自動固相DNA合成機を用いて様々な位置のA及びTを特異的に標識したDNAオリゴマーを合成した。その結果、安定同位体標識した一連のDNAをほぼルーティン的、比較的安価に調製できる見通しを得た。生化学的な方法では^<15>N塩化アンモニウム、^<13>Cグルコースで培養した大腸菌からRNAを分画して、モノヌクレオチドまで分解、酵素的にNTPにしてから、T7RNAポリメラーゼの系で合成する方法を確立した。これらの試料を用いて、完全なNMRシグナル帰属に向けての手法開発を行った。さらに平行して、溶液中の動的構造の解析法、超分子系におけるダイナミックスの解析と、精巧な分子構造決定のための方法論の開発を行った。本年度は、H-^<13>C-^<13>C=OのC-C軸まわりの内部回転角が^<13>C(=O)の化学シフトの異方性と^<13>C-H双極子結合の2次元相関NMRスペクトルのパターンとが関係づけられることを明らかにした。

研究成果

(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] E.Kawashima: "Sonochemical and triethylbornne induced tin deuteride reduction for the highly stereoselective synthesis of (2'-R)-[2-^2H]-2'-deoxyribonucleosides from 2'-functionalizeo ribonucleosides" Tetrahedron Letters. 34. 1317-1320 (1993)
[文献書誌] C.Kojima: "HAL experiment,a novel filtering method and its application to DNA assingment" J.Magn.Reson.Series B. 102. 214-217 (1993)
[文献書誌] M.Amano: "Nuclear magnetic esonance study of the codon-anticodon interaction in Bombyx mori tRNA^<gly>_<GCC>" Eur.J.Biochem.217. 131-136 (1993)
[文献書誌] T.Shida: "Structural analyses of synthetic immobile Holliday junction" Nucleic Acids Symposium Series. 29. 181-182 (1993)
[文献書誌] H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letters. 323. 252-256 (1993)
[文献書誌] H.Odawara: "Dynamic properties of nucleic acids in biosupuramolecular systems,as studied by ^<31>P-NMR" J.Biochem.115. 270-278 (1994)
[文献書誌] J.L.Markley: "NMR of Macromolecules-A Practical Approach" Oxford University Press, (1993)

1993 年度 実績報告書

核酸構造解析のための安定同位体標識多次元NMR法の開発

研究代表者

京極 好正 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90012632)

研究成果

[文献書誌] E.Kawashima: "Sonochemical and triethylbornne induced tin deuteride reduction for the highly stereoselective synthesis of (2'-R)-[2-^2H]-2'-deoxyribonucleosides from 2'-functionalizeo ribonucleosides" Tetrahedron Letters. 34. 1317-1320 (1993)

[文献書誌] C.Kojima: "HAL experiment,a novel filtering method and its application to DNA assingment" J.Magn.Reson.Series B. 102. 214-217 (1993)

[文献書誌] M.Amano: "Nuclear magnetic esonance study of the codon-anticodon interaction in Bombyx mori tRNA^<gly>_<GCC>" Eur.J.Biochem.217. 131-136 (1993)

[文献書誌] T.Shida: "Structural analyses of synthetic immobile Holliday junction" Nucleic Acids Symposium Series. 29. 181-182 (1993)

[文献書誌] H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letters. 323. 252-256 (1993)

[文献書誌] H.Odawara: "Dynamic properties of nucleic acids in biosupuramolecular systems,as studied by ^<31>P-NMR" J.Biochem.115. 270-278 (1994)

[文献書誌] J.L.Markley: "NMR of Macromolecules-A Practical Approach" Oxford University Press, (1993)

1993 年度実績報告書

京極好正大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90012632)