核酸構造解析のための安定同位体標識多次元NMR法の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05101004
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 京極 好正 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90012632)
• 研究分担者: 阿久津 秀雄 横浜国立大学, 工学部, 教授 (60029965) ; 甲斐荘 正恒 東京都立大学, 理学部, 教授 (20137029)
• キーワード: 安定同位体標識 / 固体NMR / 異種核多極子2次元相関 / 立体特異的重水素化 / 核酸 / ホリディ構造 / 内部回転角

研究概要

本年度、プリン系、及びプリミジン系のオリゴヌクレオチド類の全部、任意の位置に^<13>C、^<15>Nを導入する合成法が確立された。特に今年度は糖の2'位と5'位の2個のプロトンを選択的に重水素化することを試みて成功させた。この試料は糖の他のプロトン由来のシグナルの線幅を細くし、Vicinalなカップリング定数を読みやすくして有効である。これらの原料を用いてオリゴヌクレオチドを生化学的に合成するにはトリリン酸にしなければならない。そこの化学合成の効率を検討した。これまでは化学的な合成にこだわっていたが、今後は酵素を使った合成と組み合わせる必要がある。
2',5'に立体特異的にDを入れたヌクレオシドから合成した10塩基対DNAのスペクトルを解析して、全シグナルの帰属を行った。また糖のプロトン間の結合定数より、各残基の糖のパッカリングを計算した。NOEを測定して、この核酸オリゴマーの構造を計算した。またDNAとRNAのハイブリッドにおいて、どのような形をとるか興味がある。そのようなものを合成してスペクトルを解析してA型的な構造をとることを示した。RuvCで切断されるHolliday junctionに構造に必要な塩基配列を検討した。
^<15>N、^<13>Cで均一に標識されたアデノシンを用いて、完全帰属をする手法を開発したが、次に複数の核間の距離を求めることが出来る手法を開発している。また内部回転角を求める手法の開発は終了した。これらを具体的に適用して、束縛条件を求め、溶液と同じように固体中での立体構造を求めるプログラムを作ることが今後の課題である。

研究成果

• [文献書誌] T.Shida 他: "Characterization and Comparison of Syntheric Immobile and Mobile Holliday Junctions" J.Biochem.119. 653-658 (1996)
• [文献書誌] T.Nishizaki 他: "Solution Structures of DNA Duplexes Containing a DNA-RNA Hybrid Region,d(CG)r(AGAII)d(GAC)d(GTCATCTCC) and d(GGAGA)r(UGAC)d(GTCATCTCC)" Biochemistry. 35. 4016-4025 (1996)
• [文献書誌] A.Ono 他: "C5' Methylene Proton Signal Assignment of DNA/RNA Oligomers Iabeled with Monodeuteratted Nucleosides by 1H-31P HSQC Spectroscopy" Mag.Reson.in Chem.34. 40-46 (1996)
• [文献書誌] A.M.Ono 他: "Synthesis of (5'S)-[5'-2H1:1',2',3',4',5'-13C_5]-Themidine via Stereoselective Deuteration of a 5-Oxoribose Derivative" Tetrahedron Lett.38. 395-398 (1997)
• [文献書誌] K.Tozawa 他: "Unusual pKa of the carboxylate at the putative catalytic position of the thermophilic F1-ATPase subunit determined by 13C-NMR" FEBS Lett.397. 122-126 (1996)
• [文献書誌] T.Fujiwata 他: "Multidimensional solid-state nuclear magnetic resonance for correlating anisotropic interactions under magic-angle spinning conditions" J.Magn.Reson.124. 147-153 (1997)