時間分割ラウエ法利用研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05244101
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)
• 研究分担者: 田之倉 優 東京大学, 生物生産工学研究セ, 教授 (60136786) ; 西野 武士 日本医科大学, 医学部, 教授 (40094312) ; 森島 績 京都大学, 工学部, 教授 (50026093) ; 小田 順一 京都大学, 化学研究所, 教授 (50027041) ; 勝部 幸輝 大阪大学, 蛋白質研究所, 名誉教授 (20032013) ; 楯 真一 東京都立大学, 理学部, 助手 (20216998) ; 上杉 晴一 横浜国立大学, 工学部, 教授 (70028851)
• キーワード: X線結晶構造解析 / ラウエ法 / 時間分割解析 / 蛋白質の構造 / 蛋白質の動的構造 / NMR分光法 / 緩和時間測定 / ケージ化合物

研究概要

以下、交付申請書の『本年度の研究実施計画』欄のA1)〜A4)に対応させて述べる。
A1)ヘム蛋白質についての、時間分割ラウエ法及びNMR分光法による研究(森島)
新たに、Leu 29をPheに置換したミオグロビンを調製し、静的構造が天然のものと殆ど違わないのに、COを再結合する速度が著しく異なることを見出した。また、E-ヘリックスとF-ヘリックスの間にジスルフィド結合を導入した変異体を調製した。
A2)ヌクレオチドを結合する酵素についての、時間分割ラウエ法及び酵素化学による研究(勝部、小田、西野)
グルタチオン合成酵素について、caged-ATPとの複合体の結晶化に成功し、この結晶中におけるcaged-ATPの光分解条件をも確立した。また、反応生成物の一つであるADPの定量法を確立し、ATP→ADP交換の速度を測定したところ、結晶中では、溶液中の150倍の時間を要することが判明した。キサンチン脱水素酵素については、3Aを越える分解能の結晶の作成に成功した。
A3)加水分解酵素についての時間分割ラウエ法及び酵素化学による研究(三井、上杉、田之倉)
caged-CpUを合成し、約2分の光照射で50%分解されることを確かめた。ニトロベンジル基と塩基との相互作用は非常に弱い。しかし、caged-CpUの三方晶系リボヌクレアーゼA結晶への導入には失敗した。溶解度を上げるためのDMSOが元凶である。一方、PEG存在下でのリボヌクレアーゼSの単斜晶を新たに発見した。この溶媒系では溶解度の問題は無いものと期待される。クロコウジカビ由来の酸性プロテアーゼAについては、ラウエ法による結晶の劣化過程について多様な経験を深めた。
A4)蛋白質構造のダイナミックスを追及するための新しいNMR分光法の開発(楯、三井)
シスタチンAの溶液構造を精密化することに成功した。次に、アミドプロトンの交換現象からミリ秒域の構造揺らぎの様相について観測した。この結果、同じ二次構造内でも、中央と端では揺らぎの大きさが異なる等の画期的な定量的データが得られた。

研究成果

• [文献書誌] Irie,M.,Ohgi,K.,Watanabe,H.,Iwama,M.,Nakamura,K.T.,Kurihara,H.,Nonaka,T.,Mitsui,Y.,Horiuchi,H.& Takagi,M.: "pH Profile of kinetic constants of RNase Rh and possible mechanism of the enzyme." J.Biochem.(Tokyo). 115. 1083-1087 (1994)
• [文献書誌] 楯 真一、甲斐荘正恒: "多次元NMRによる蛋白質の分子内運動の解析" 蛋白質・核酸・酵素. 39. 1066-1077 (1994)
• [文献書誌] KATO H.,TANAKA T.,YAMAGUCHI H.,HARA T.,NISHIOKA T.,KATSUBE Y.ODA J.: "Flexible loop That is Novel Catalytic Machinery in a Ligase.Atomic Structure and Function of the Loopless Glutathione Synthetase" Biochemistry. 33. 4995-4999 (1994)
• [文献書誌] Ishimori,K.,Hashimoto,M.,Imai,K.,Fushitani,K.,Miyazaki,G.,Morimoto,G.,Wada,G.and Morishima,I.: "Site-Directed Mutagenesis in Hemoglobin" Biochemistry. 33. 2546-2553 (1994)
• [文献書誌] A.Sato,T.Nishino,K.Noda,Y.Amaya and T.Nishino:"The structure of chicken liver xanthine dehydro-genase:cDNA cloning and the domain structure." J.Biol.Chem.6. 2818-2826 (1995)
• [文献書誌] T.Nishino: "The conversion xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase and the role of reperfusion injury." J.Biochem.116. 1-6 (1994)
• [文献書誌] Senda,T.,Nonaka,T.,Nakamura,K.T & Mitsui,Y.: "“Synchrotron Radiation in Biosciences"" Clarendon Press, 8 (1994)
• [文献書誌] 勝部幸輝: "蛋白質 核酸 酵素 Vol.40,NO.3" 蛋白質結晶構造解析法の最近の進歩ーシンクロトロン放射光の利用-, 10 (1995)