リポ多糖刺激を介して血管内皮細胞で発現する組織因子の分子機能解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05256225
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• 研究分担者: 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• キーワード: 血液凝固組織因子 / VII因子 / 外因系凝固反応 / VII因子-TF複合体 / 酵 母 / TF-リコンビナント / ウシ血液凝固因子 / セリンプロテアーゼチモーゲン

研究概要

外傷などに伴って組織因子が血液中に露呈されると、この因子が血血漿中のVIIa因子と分子複合体を形成しつつ、外因系凝固反応を開始する。我々は両因子間の相互作用を分子レベルで明らかにする目的で、VIIa因子上の組織因子結合部位の解析を行ない、2つの組織因子結合部位を見い出した。また、酵母を用いた発現系により、ウシ可溶性リコンビナント組織因子(rsTF,TF1-213)の大量調整に成功した。今回、このrsTFを用い、組織因子側のVIIa因子結合部位の解析を行なった。まず、VIIa-rsTF複合体による合成基質(S-2288)水解系に、ペプチドクロロメチルケトン処理によって不活化したVIIa因子、Gla-domainlesVIIa因子(VIIa(GD-))及び前駆体型VII因子を加えて拮抗阻害実験を行なった結果、不活化VIIa因子とVIIa(GD-)が強い阻害(IC_<50>=70nM)を示したのに対し、前駆体型VII因子では殆ど阻害が見られなかった(IC_<50>>900nM)。従って、rsTFはVIIa因子上の2つの組織因子結合部位のうち活性型VIIa因子に特異的に発現しているひとつを認識することが示唆された。また、この性質を利用して不溶化rsTFカラムにより、前躯体型VII因子中のきょう雑VIIa因子を特異的に除去することに成功した。一方、rsTFを、穏和な条件下トリプシン処理すると、Arg129-Ala130間のペプチド結合が切断され、切断後も約60%の活性が残存していた。そこで、両断片の分別を試みたが、1-129と130-213の断片は5M尿素存在下、分別されたものの、コファクター活性とVIIa因子結合能は共に消失した。現在、化学修飾法などを用いてVIIa因子結合部位を解析しつつある。

研究成果

• [文献書誌] Fuminori Tokunaga: "Limulus Hemocyte Transglutaminase: Its Purification and Characterization,and Identification of the Intracellular Substrates." J. Biol. Chem.268. 252-261 (1993)
• [文献書誌] Fuminori Tokunaga: "Limulus Hemocyte Transglutaminase: cDNA Cloning, Amino Acid Sequence, and Tissue Localization." J. Biol. Chem.268. 262-268 (1993)
• [文献書誌] Hitoshi Nishimura: "Factor IX Fukuoka:Substitution of Asn-92 by His in the Second Epidermal Growth Factor-like Domain Results in Defective Interaction with FactorsVIII/X." J. Biol. Chem.268(32). 24041-24046 (1993)
• [文献書誌] Sadaaki Iwanaga: "Intracellular LPS-binding Proteins and Peptides Found in Limulus Hemocytes." Proceedings of the 2nd Conference of the International Endotoxin Society(Ed.by J. Levin,et al.). 185-192 (1993)
• [文献書誌] Tatsushi Muta: "Horseshoe Crab Coagulation Factor B: A Unique Serine Protease Zymogen Activated by a Cleavage between Ile-Ile Bond." J.Biol. Chem.268. 21384-21388 (1993)
• [文献書誌] Shun-ichiro Kawabata: "Rebbit Liver Microsomal Endopeptidase with Substrate Specificity for processing proproteins is Structurally Related to Rat Tests Metalloendopeptidase 24.15." J.Biol. Chem.268(17). 12498-12503 (1993)
• [文献書誌] 西村 仁: "血液凝固系(プロテアーゼとそのインヒビター、生理的意義および病態との関連、早石修 監修)" メジカルビュー社, 11 (1993)
• [文献書誌] 西村 仁: "糖鎖の多様な世界" 講談社サイエンティフィク, 16 (1993)