ヒトヘムオキシゲナーゼ遺伝子の熱ショックエレメントの機能の抑制機構

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05268202
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 藤田 博美 東北大学, 医学部, 助教授 (60142931)
• 研究分担者: 柴原 茂樹 東北大学, 医学部, 教授 (70206142)
• キーワード: ヘムオキシゲナーゼ / 熱ショック蛋白質 / 遺伝子発現 / サイレンサー / ストレス応答

研究概要

熱ショック蛋白質(HSP)は熱などの種々の環境因子によって誘導される一群の蛋白質であり、HSP遺伝子のプロモーター領域には熱ショックエレメント(HSE)と呼ばれる共通の塩基配列が存在する。HSEは熱ショック転写因子(HSF)の結合部位であり、HSEが1コピーでもプロモーター領域に存在すれば、その下流にある遺伝子の転写が熱ショックにより誘導される。ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解の律速酵素であり、通常、組織・細胞におけるHO活性は低いが、基質であるヘムや重金属などで誘導される。実際、ラットHOは32kDaの熱ショック蛋白質として知られている。一方、ヒトHO遺伝子のプロモーター領域には、既知のHSEと完全に一致する塩基配列が存在するにもかかわらず、ヒト正常細胞では熱ショックによるHOの誘導がおこらない。我々は同遺伝子のプロモーター領域にHSEの機能を抑制するような塩基配列(サイレンサー)の存在を想定しており、同サイレンサーに関して、以下の成果を得た。
1.ヒト正常細胞(肺胞マクロファージ)を42℃で培養したところ、代表的なHSPであるHSP70は誘導されたが、HOは全く誘導されなかった。よって、ヒトHOはHSPではない。
2.ヘミンによるヒトHOの誘導は熱ショックにより阻害される。HOはヘミンあるいはカドミウムなどの重金属によって、転写レベルの誘導を受ける。しかし、ヘミン処理を42℃で行うと、HOmRNAの誘導が全く見られなかった。
3.試験管内ではHSFはヒトHO遺伝子プロモーター領域に存在するHSE(HO-HSE)に結合する。熱ショック(42℃)後のまたは無処理のHeLa細胞より核抽出液を調製し、HO-HSEにHSFが結合することをゲルシフト法で確認した。なお、HeLa細胞の熱ショック蛋白質70(HSP70)は熱ショックにより誘導されるが、HOは誘導されない。
4.HO-HSEに対するサイレンサー配列の存在。ヒトHO遺伝子の5'上流領域(約2kb)をプロモーターとし、その下流に大腸菌の遺伝子gpt(xanthine-guanine phosphoribosyltransferase)をレポーターとして持つような融合遺伝子をHeLa細胞に導入し、42℃処理がレポーター遺伝子の一時的発現に与える影響を調べた。なお、gptの発現をS1マッピングで定量した。HHO-HSEの近傍に種々の欠損を持つ融合遺伝子を用いて、熱ショックによる誘導の有無を解析し、サイレンサー機能を持つ塩基配列の存在を確認した。

研究成果

• [文献書誌] Shibahara,S.: "Heme Oxygenase-Regulation of and Physiologicel Implication in Heme Catabolism" in Regulation of Heme Protein Synthesis (Alpha Med Press,Ohio,USA) ed.Fujita,H.103-116 (1994)
• [文献書誌] Mitani,K.et al.: "The role of inorganic metals and metalloporphyrins in the induction of haem oxygenase and heat-shock protein 70 in human hepatoma cells" Biochem.J.290. 819-825 (1993)
• [文献書誌] Katayose,D.et al.: "Separate regulation of heme oxygenase and heat shock protein 70 mRNA expression in the rat heart by hemodynamic stress" Biochem.Biophys.Res.Commun.191. 587-594 (1993)
• [文献書誌] Okinaga,S.et al.: "Identification of a nuclear protein that constitutively recognizes the sequence containing a heat-shock element" Eur.J.Biochem.212. 167-175 (1993)