免疫応答におけるT細胞レセプター・クロノタイプ検出システムの確立と免疫病への応用

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05272101
• 研究機関: 聖マリアンナ医科大学
• 研究代表者: 山本 一彦 聖マリアンナ医科大学, 難病治療研究センター, 助教授 (80191394)
• 研究分担者: 間藤 卓 東京大学, 医学部, 助手 ; 加藤 智啓 聖マリアンナ医科大学, 難病治療研究センター, 助手 (80233807)
• キーワード: T細胞 / T細胞レセプター / クロノタイプ / RCP

研究概要

ヒトおよびマウスのT細胞レセプター(TCR)beta鎖について、そのクロノタイプ検出システムの確立をすすめた。方法としては当初行っていたPCRの為のCbetaプライマーに直接ビオチンを標識して、最終的にSSCPにてシグナルを検出をする方法は、PCR反応でTCR以外のシグナルをも増幅してしまうことから特異性の点で問題となった。そこでSSCP泳動後これをナイロンメンブレンに転写し、さらに内側に近接したCbetaプローブでハイブリダイズする方法を確立し、特異性を高めた。さらにバンドとして検出されるTCRクロノタイプの塩基配列決定は、バンドからのDNAの抽出と二次PCR反応の後直接シークエンス法を試みたが、再現性の良い決定は難しいことが判明した。そこで二次PCR産物をプラスミドベクターに組換えクローニングした後、シークエンスを行う方法にを行い、良好な成績を得た。
実際の解析の結果では、ヒト、マウスともに、試験管内での特異抗原刺激により、それに反応するクロノタイプがCD4、CD8別にダイナミックに変わっていく状態を検出することが可能となった。またヒト健常人末梢血中のリンパ球はTCRbeta領のクロナリティーからみて限りなくヘテロの集団であるが、その中にCD8陽性のクローンが10個前後安定して存在することも判明した。健常人が感冒に罹患するとその末梢血中に集積しているクローンもダイナミックに変化し、CD4陽性T細胞は反応しクローンを形成する時間及び半減期ともに短く、CD8陽性T細胞は反応も遅いが、血中からの消失にも時間がかかることが明らかとなった。これらの結果をもとに、種々の疾患患者検体及びマウスモデルでのTCRクロノタイプの動きを検討中である。

研究成果

• [文献書誌] M.Dohi: "Accumulation of multiple T cell clonotypes in lungs of healthy individuals and pafients with palinonary sarcoidsis" J.Immunol.(in press).
• [文献書誌] J.Yagi: "Superantigen‐like properties of the bispecific antibody specific for MHC Class II moiecule and Vp domain of the T cell antigen receptor." J.Immunol.(in press).
• [文献書誌] T.Kato: "An improved bacterial expression vector producing a thrombincleavable fusion protein." Mol.Biol. (in press).
• [文献書誌] T.Hasunuma: "Establishment and characterization of synavial cell clones with integrated human T‐cell leukemia virus type‐I." Clin.Immunol.Immunopathol.(in press).
• [文献書誌] M.Okubo: "Detection and epitope analysis of autoantigen‐reactive T cell to the UI‐small nuclear ribonucleoprotein A protein in autoimmune disease patients." J.Immunol.151. 1108-1115 (1993)
• [文献書誌] T.Nakajima: "Overgrowth of human synovial cell driven by the human T cell leukemia virus type I tax gene." J.Clin.Invest.92. 186-193 (1993)
• [文献書誌] T.Kato: "Identification of universal B‐Cell epitope on DNA topoisomerase I,an autoantigen associated with Scleroderma." Arthritis Rheum.36. 1580-1587 (1993)
• [文献書誌] Y.Misaki: "B‐cell epitope on the UL snRNP‐C autoantigen contains a similar Sequence with herpes Simplex Viras protein." Eur.J.Immunol.23. 1064-1071 (1993)