遺伝子治療の基礎研究

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05354012
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 松田 一郎 熊本大学, 医学部, 教授 (10000986)
• 研究分担者: 島田 隆 日本医科大学, 教授 (20125074) ; 香川 靖雄 自治医科大学, 教授 (30048962) ; 成澤 邦明 東北大学, 医学部, 教授 (90004647) ; 多田 啓也 東北大学, 医学部, 教授 (20046907) ; 森 正敬 熊本大学, 医学部, 教授 (40009650)
• キーワード: 遺伝子治療 / レトロウイルスベクター / アデノウイルスベクター / リポソーム / ジーンターゲッテイング / 遺伝名 / ミトコンドリア病 / 白血病

研究概要

研究班の目的は、遺伝子治療に向けての基礎的研究で、以下に述べる2本の柱を立てて行われた。
1.治療を目的とした遺伝子導入に関する研究
この研究の目的は遺伝子を目的細胞(組織)に導入する場合のベクターの開発、トランスフェクションの手法の改善、発現率増強のための手法の開発、導入した遺伝子の安定性の確保、さらには遺伝子導入により引き起こされる癌化の防止策の検討など、遺伝子導入に際して考えられる様々な問題を検討した。
遺伝子導入ベクターとして島田(隆)はHIVに着目した。これはレトロウイルスの一種でCD4陽性リンパ球に特異的に感染し、非分裂細胞の染色体に組み込まれる。このことから今後研究を重ねれば先天免疫不全、AIDS、癌の治療に利用できることを示唆した。斉藤はアデノウイルスベクターについて研究した。特にSRa、EF1a、CAG 3種のプロモーター活性につき検討しCAGがなかでも最も強力であることを見いだした(特許申請中)。島田(和)は遺伝子治療の理想的手法であるシーンターゲッテイングを用いた方法の開発を目指して、その効率を上げ、安定性を得る手法を検討した。そして、ヘルペスウイルスベクターの3′端を修飾することにより、細胞内でのベクターの安定性を得た。中西はセンダイウイルスがもつ膜融合性を利用し、リポゾームにこれを植え込んだ担体を開発した。また直接センダイウイルスをベクターに利用する手法も検討している。これは金田によっても追求されている。香川はミトコンドリア病の解明を精力的に行い、加えて、mtDNAパーテイクル銃を用いた、本症の遺伝子治療の基礎研究にも着手した。
2.遺伝子発現機構の解明と疾患との対応に関する研究
この研究の目的は遺伝子病(癌も含む)での遺伝子発現機構の異常を解明し、それが修復手法(治療)の対象になり得るか否かを検討するものである。なお、この研究にあたっては培養細胞や動物モデルでの検討が考えられる。遺伝子病の発症機構の解明がより詳細に究明されなければ、仮に遺伝子導入が成功しても、治療効果に結びつかない可能性もある。遺伝子発現機構(5′上流変異、胎児期突然変異、モザイクの解明、転写因子異常など)の解明はどの疾患に遺伝子治療の優先権を与えるかという問題にもつながる重要な研究である。
導入した遺伝子が本来の調節を受けて発現する方法はいろいろあるが、今井はその1つとして酵母人工染色体(YAC)を用いて数百kbの遺伝子単位を細胞に導入し、発現パターンを研究する手法を開発した。森は肝型アルギナーゼをモデルとして、その上流を解析し、導入遺伝子の発現効果を上げる工夫をした。平井はアンチセンスオリゴヌクレオチド法を用いてヒト白血病の治療の可能性を追及し、期待できる成果をあげた。谷はヒトのピルビン酸キナーゼ欠損症の治療を目標とし、マウスの骨髄細胞にレトロウイルスベクターを用いてこの遺伝子導入の実験を始めた。多田、折居はそれぞれプロピオン酸血症、ペルオキシゾーム病をとりあげ、その遺伝子解析を進め、将来の遺伝子治療に備えるデーターを集積した。
成澤、松田はフェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、モデル動物を用いて遺伝子治療の実験を開始した。

研究成果

• [文献書誌] Nobukuni Y.,et al.: "Heterogeneity of mutations in maple syrup urine disease(MSUD):Screening and identification of affected E_1alpha and E_1beta subunits of branched-chain alpha keto acid dehydroxygenase multienzyme complex." Biochem.Biophys.Acta.1225. 64-70 (1993)
• [文献書誌] Hoshide R.,et al.: "A specificity of PCR-SSCP for detection of the mutant ornithine transcarbamylase (OTC)gene in patients with OTC deficiency." J.Inher.Metab.Dis.16. 857-862 (1993)
• [文献書誌] Hoshide R.,et al.: "Carbamyl phosphate synthetase I deficiency ; one base substitution in exon of the CPSI gene causes a 9bp deletion due to aberrant splicing." J.Clin.Invest.91. 1884-1887 (1993)
• [文献書誌] Matsuura T.,et al.: "Four novel gene mutation in five Japanese male patients with neonatal or late onset OTC deficiency : Application of PCR-SSCP for all exons and adjacent introns." Human Genet.92. 49-56 (1993)
• [文献書誌] Matsuura T.,et al.: "Prenatal monitaring of ornithine transcarbamylase deficiency in two families by DNA analysis." J.Inh.Metab.Dis.16. 31-38 (1993)
• [文献書誌] Nakazato H.,et al.: "Identification of a single base insertion in COL4A5 gene in alport syndrome." Kidney Internat.44. 1091-1096 (1993)
• [文献書誌] Ohura T.,et al.: "Propionic acidemia : Sequence analysis of mutant mRNA from Japanese beta subunit-deficient patients." J.Inher.Metab.Dis.16. 863-867 (1993)
• [文献書誌] Tada,K.,et al.: "Nonketotic hyperglycinemia : Molecular Lesiom,Diagnosis and pattophysiology." J.Inher.Metab.Dis.16. 692-703 (1993)
• [文献書誌] 大浦敏博: "プロピオン酸血症" 小児科. 34. 1287-1291 (1993)
• [文献書誌] 松原洋一他: "遺伝病の遺伝子治療" 臨床分子遺伝学. 1. 179-183 (1993)
• [文献書誌] Kondo T.,et al.: "Temerature sensitive phenotype of a mutant Sendai virus strain is cansed by its insufficient acumulation of the M protein." The Journal of Biological Chemistry.268. 21924-21930 (1993)
• [文献書誌] Kato k.,et al.: "Use of the Hemagytinating virus of Japan-loposome methed for analysis of infirinating lymphocytes.induced by hepatitis B virus gene expression in liva tissue." Biochimeca et Biophysica Acta. 1182. 283-290 (1993)
• [文献書誌] Takiyama,Y.,Kagawa,Y.,et al.: "The gene for Machado-Joseph disease maps to human chromosome 14q." Nature Genetics. 4. 300-304 (1993)
• [文献書誌] Sunada,Y.,Kagawa,Y.,et al.: "Inherited amyloid polyneuropathy type IV (gelsolin variant) in a Japanese family." Ann.Neurol.33. 57-62 (1993)
• [文献書誌] Matsuda,C.,Kagawa,Y., et al.: "Gene structure of human mitochondrial ATP synthase gamma-subunit:Tissue-specificity produced by alternative RNA splicing." J.Biol.Chem.268. 24950-24958 (1993)
• [文献書誌] Tominaga,K.,Kagawa,Y.,et al.: "Smaller isoform of human mitochondrial transcription factor 1:Its wide distribution and production by alternative splicing." Biochem.Biophys.Res.Commun.194. 544-551 (1993)
• [文献書誌] Nakanishi,M.,Kagawa,Y.,et al.: "Purification and reconstitution of an intestinal Na+-dependent neutral L-alpha-amino acid transporter." J.Biol.Chem.269,(in pr.). (1994)
• [文献書誌] Hayashi,J-I.,Kagawa,Y.,et al.: "Nuclear but not mitochondrial genome involvement in human age-related mitochondrial dysfunction.Functinal integrity of mitochondrial DNA" J.Biol.Chem.269. (in pr.) (1994)
• [文献書誌] R.Morishita,et al.: "Novel and effective gene transfer technique for study of vascular renin angiotensin system" J.Clinical Investigation. 91. 2580-2585 (1993)
• [文献書誌] N.Tomita,et ai.: "Hypertensive rats produced by in vivo introduction of the human renin gene" Circuration Research. 73. 898-905 (1993)
• [文献書誌] A.Uchiyama,et al.: "Transfection of interleukin-2 gene into human melanoma cells augments cellular immune response" Cancer Research. 53. 949-952 (1993)
• [文献書誌] R.Morishita,et al.: "Single intraluminal delivery of antisense cdc2 kinase and PCNA oligonucleotides results in chronic inhibition of neointiman hyperplasia" Proc.Natl.Acad.Sci.(USA). 90. 8874-8878 (1993)
• [文献書誌] Y.Kaneda,et al.: "The analysis of 40 kDa nuclear protein ,p40,in interphase cells and mitotic cells" J.Cell Science. 106. 741-748 (1993)
• [文献書誌] Y.Isaka,et al.: "Glomerulosclerosis induced by in vivo transfection with TGF-beta or PDGF gene into rat kidney" J.Clinical Investigation. (in press).
• [文献書誌] V.Episkopou: "Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 2375-2379 (1993)
• [文献書誌] K.Yamamura: "Transgenic mouse model human genetic diseases" Molec.Reproduc.Develop.36. 248-250 (1993)
• [文献書誌] T.Matsuura: "Four novel gene mutations in five Japanese male patients with neonatal or late onset OTC deficiency:Application of PCR-singli-strand conformation polymorphisms for all exons and adjacent introns" Hum.Genet.92. 49-56 (1993)
• [文献書誌] K.Horie: "Structure of replacement vectors for efficient gene targeting" J.Biochem.(Tokyo). (in press). (1994)
• [文献書誌] M.Nomura: "Isolation and characterization of retinoic acid inducible cDNA clones in F9 cells:One of the early inducible clones encodes a novel protein sharing several highly homologous regions with a Drosophila polyhomeotic protein" Differentiation. (in press). (1994)
• [文献書誌] 島田和典: "マウス胚性幹細胞を利用したヒト疾患モデル動物の作製" 学術月報. 46. 833-837 (1993)
• [文献書誌] Chiba Y,m et al.: "Purufucation and properties of liver holocarboxylase synthetase." Arch.Biochem.Biophys.(in press).
• [文献書誌] Ohura T.,et al.: "The molecular defict in propionic acidemia : exon skipping caused by an 8-bp deletion from an intron tn the PCCB allele." Human Genet.92. 397-402 (1993)
• [文献書誌] Aoki M.,et al.: "Mild amyotrophic lateral sclerosis in Japan associated with novel SOD mutation." Nature Genet.5. 323-324 (1993)
• [文献書誌] Masuno M.,et al.: "Assignment of the human peroxisome assenby factor-1 gene (PXMP3) responsible for Zellweger syndrome to chromosome 8q21.1 by flunorescence in situ hybridization." Genomics(in press).
• [文献書誌] Suzuki Y.,et al: "Novel subtype of peroxisomal acyl-coA oxidase deficiency and bifunctional enzyme deficiency with detectable enzyme protein : Identification by means of complementation analysis." Am.Hum.Genet.54. 36-43 (1994)
• [文献書誌] Shimozawa N.,et al.: "Standardization of complementation groping of peroxisome-deficient disorders and the second Zellweger patient with PAF-1 defect." Am.J.Hum.Genet.52. 843-844 (1993)
• [文献書誌] Shimozawa N.,et al.: "Prenatal diagnosis of Zellweger syndrome using DNA analysis." Prental Diagnosis. 13. 149-149 (1993)
• [文献書誌] 島田 隆: "遺伝子治療-最近の進歩" 実験医学. 12. 15-19 (1994)
• [文献書誌] 平井幸彦他: "adeno-associated virus(AAV)ベクターによる遺伝子治療" 実験医学. 12. 35-39 (1994)
• [文献書誌] Shirasaka.,et al: "Changes in drug sensitirity of human immunodeficiency type 1 during therapy with azidothymidine,dideoxycytidine and dideoxyinosine." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 562-566 (1993)
• [文献書誌] 島田 隆: "抗HIV遺伝子を使った遺伝子治療の可能性" 日本臨床. 51. 229-234 (1993)
• [文献書誌] 新谷英滋: "遺伝子治療に用いるベクター:HIV" 治療学. 27. 1413-1418 (1994)
• [文献書誌] Mitani K.,et al.: "Generation of the AML1/Evi-1 fusion gene in the t(3;21)(q26;q22)causes blastic crisis in chronic myelocytic leukemia." EMBO J.(in press).
• [文献書誌] Toyoshima H.,et al.: "Defferently spliced cDNAs of human ltk receptor tyrosine kinase predict receptor proteins with and without tyrosine kinase domain and a soluble receptor protein." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 5404-5408 (1993)
• [文献書誌] Sugimoto K.,et.al.: "Mutations of the p53 gene in myelodysplastic syndromes and MDS-derived leukemia." Blood. 81. 3022-3026 (1993)
• [文献書誌] Hanazono Y.,et al.: "C-fps/fes protein-tyrosine kinease is implicated in a signaling pathway triggered by granulodte-macrophge cdony-stimuilating factor and interleukin-3." EMBO J.12. 1641-1646 (1993)
• [文献書誌] Hanazono Y.,et al.: "Erythropoietin induces tyrosine phosphorylation and kinase activity of the c-fps/fes proto-oncogene product in human erythrropoietin-responsive cells." Blood. 81. 3193-3196 (1993)
• [文献書誌] Sasaki K.,et al.: "Coordinate expression of the alpha and beta chains of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor confers logand-induce morphological transformation in mouse fibroblasts." J.Biol.Chem.268. 13697-13702 (1993)
• [文献書誌] Matsuno F.,et al.: "A novel ornithine transcarbamylase present in mycoplasma-infected myeloma cells." Enzyme & protein. (in press).
• [文献書誌] Nishiyori A.,et al.: "Determination of tissue-specificity of the enhancer by combinational operation of tissue-enriched transcription factors : Both Hnf-4 and C/EBP beta are required for liver specific activity of the ornithine transcarbamylase enhancer." J.Biol.Chem.(in press).
• [文献書誌] Gotoh T.,et al.: "The delayed glucocorticoid-responsive and hepatoma cell-selective enhancer of the rat arginase gene is located around intron 7." J.Biochem.(in press).
• [文献書誌] Kimura A.,et al.: "COUP-TF represses transcription from the promoter of the gene for ornithine transcarbamylase in a manner antagonistic to HNF-4" J.Biol.Chem.268. 11125-11133 (1993)
• [文献書誌] Sarashina T.,et al.: "Nucleotide swquence of the hepatitis C virus genome from a patient negative for anti-HCV by the first antibady assay." Nucleic Acids Research. 21. 1037-1037 (1993)
• [文献書誌] Ueno T.,et al.: "Immortalization of differentiated human hepatocytes by a combination of a viral vector andcollagen gel culture." Human Cell. 6. 126-135 (1993)
• [文献書誌] Kim D.-W.,et al.: "An efficient expression vector for stable expression in human liver cells." Gene. 134. 307-308 (1993)
• [文献書誌] Matsuura Y.,et al.: "Expression of E_1 and E_2/NS_1 proteins of HCV in mammalian and insect cells." Vaccines93. 93. 289-294 (1993)
• [文献書誌] Nakanishi M.,et al.: "Trends and Futnre Perspectives in and Drug Delivery." Harwood Academic Publishers gmbh.(Netherlads),(in press), (1994)
• [文献書誌] Nakanishi M.,et al.: "Intractable Neurological Disorders,Human Genome Research ad Society" Enbios Ethies Institute(Tsukuba Japan),(in press), (1994)
• [文献書誌] 香川靖雄: "生体膜と疾患の分子生物学" 南山堂 東京, 560 (1993)
• [文献書誌] 香川靖雄、野沢義則: "図説医化学" 南山堂 東京, 486 (1993)
• [文献書誌] Y.Kaneda,et al.: "Methods in Enzymology" Academic Press,Inc.Orlando Florida, 462 (1993)
• [文献書誌] Y.Kaneda: "A laboratory handbook" Academic Press,Inc.Orlando Florida,(in press),
• [文献書誌] 島田和典: "「分子病理学-疾病の分子機構」、杉山武敏編、家族性アミロイドポリニューロパチー" 文光堂(東京), 5 (1993)
• [文献書誌] 島田和典: "「遺伝病」(島田和典編)" 化学同人社(京都), 191 (1993)
• [文献書誌] Matsubara Y.,et al.: "New Developments Fatty Acid Oxidation" Wiley-liss, 595 (1992)
• [文献書誌] 下沢伸行他: "ペルオキシソーム欠損症 神経疾患の分子医学 辻省次(編)" 羊土社, 148 (1993)