| 研究概要 |
1.CD腸管特異蛋白cDNA、ゲノムDNAのクローニング
CD腸管から抽出したRNAよりmRNAを溶出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。Dasらの方法に準じ粗蛋白を精製しシークエンサーにかけ、N末端からの一部のアミノ酸配列の決定を試みたが、粗蛋白の精製が不十分なため満足し得る情報が得られず、さらに精製過程を追加するも回収率が減少し十分でないことが判明した。そのためライブラリーの特異性を高めるために、健常腸管から抽出したmRNAに前述のcDNAをアニールさせ、ハイドロキシアパタイトカラムを用いてハイブリダイズしなかったcDNAを抽出(サブトラクション)した。また粗蛋白をさらに精製するためと、スクリーニングの効率を高める目的で、疾患特異的なモノクローナル抗体を作製中である。
2.CD腸管におけるMycobacteria、真菌などの検出とその特異性の検討
CD,UC,IBD以外の腸炎および対照の腸管組織の生検、手術標本からDNAおよびRNAを抽出した。Mycobacteria全体を認識するM.tuberculosisのDnaJ遺伝子の塩基配列よりプライマーを作成し、サーマル・サイクラーによりPCRやRT-PCRでDNAの合成を繰り返した。その産物をアガロース電気泳動で検定した。Mycobacteriaについては検体数がまだ不十分であり、現時点では有意な成績は得られておらず、さらに検体数を増やしている状況である。また分離される微生物が二次的なものか否かを検討するため、Mucor racemosis,Sacchromyces cerevisiae,Candida albicansなどの真菌や麻疹ウィルスを認識するプライマーを作成し、サーマル・サイクラーによりNested PCRやNested RT-PCRでDNAの合成を繰り返し同様に検定した。麻疹については特異的な産物は得られず病因としての関与は否定的と考えられた。真菌類についてはコントロールとの有意差がなく2次的な関与が推定される。
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