| 研究課題/領域番号 |
05404073
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| 研究分担者 |
二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
岩井 成憲 北海道大学, 薬学部, 助手 (10168544)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856)
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| キーワード | 紫外線損傷DNA / チミンダイマー / PCRクローニング / シングル鎖抗体 / フレキシブルリンカー |
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| 研究概要 |
1)チミン2量体(チミンダイマー)を含むDNA断片の合成
適当な保護基を導入したチミジン2量体に紫外線照射を行った後、3'-ホスホアミダイト体とすることによりチミンダイマーを含んだ結合ユニットとした。チミンダイマーを含んだオリゴヌクレオチド(dGCGGTTGGCG)をこの結合ユニットを用いてDNA合成機により大量合成した。また、相補鎖(dCGCCAACCGC)を合成した後、ハイブリダイズさせて2本鎖DNAの抗原として用いる。
2)チミンダイマー認識抗体の可変領域(Fv)遺伝子クローニング
マウス抗体のFv遺伝子配列のデータベースをもとにして、可変領域H鎖(V_H)および可変領域L鎖(V_L)遺伝子のそれぞれの5'側および3'側にプライマーを設計した。紫外線損傷DNA認識抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、PCR法によってV_HおよびV_L遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。
3)シングル鎖抗体(scFv)遺伝子の構築
V_HおよびV_L両遺伝子を(Gly_4-Ser)_3というアミノ酸配列をもつフレキシブルリンカー部分の遺伝子(鎖長52merの2本のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたもの)を介して、T4DNAリガーゼにより結合させ、scFv遺伝子を得た。
4)scFv遺伝子の大腸菌内での発現
scFv遺伝子をT3ファージRNAポリメラーゼのプロモーター、lacのオペレーターおよびErwinia carotovoraのpel Bシグナル配列が存在する発現ベクターに導入後、lacのプロモーターおよびオペレーターの下流にT3ファージRNAポリメラーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミドDNAをもつ大腸菌BL21株中でscFv遺伝子の発現を試みた。
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