時間分解共鳴ラマン分光法によるタンパク質の速い構造変化の検出

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05453212
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 北川 禎三 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 教授 (40029955)
• 研究分担者: 小倉 尚志 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 助手 (70183770)
• キーワード: 共鳴ラマン / 時間分解ラマン分光 / ミオグロビン / チトクロム酸化酵素 / 蛋白質分子動力学

研究概要

酵素が示す特異的反応性は、反応中心における触媒活性に加えて、それをとりまく蛋白質の合目的的な構造変化が重要である。未反応の基質を取込み、生成物を放出するメカニズムがあって初めて酵素は繰返し反応できる。その役割を担うのが蛋白質部分であり、それはかなり速いコンフォメーション変化を含む。本研究では呼吸系において酸素を水に変える酵素であるチトクロム酸化酵素と、酸素貯蔵タンパクであるミオグロビンの反応中間体を時間分解共鳴ラマン分光法で追跡した。ウシ心筋チトクロム酸化酵素と一酸化炭素との複合体をレーザー光で光解離させることによりO_2との反応をスターとさせ、a_3ヘムに結合するO_2に4個の電子を伝達していった各段階における共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素同位体でシフトするバンドを調べ、Fe^<III>-O_2^-→Fe^<III>-O-O-Cu^<II>→Fe^<IV>=O→Fe^<III>-OHと変化していくことを初めて確立し、本酵素の60年間に及ぶ研究の歴史にブレークスルーを作った。ミオグロビンの分子構造はdeoxy型もoxy型も1.5Å分解能のX線結晶解析で明らかにされているが、そのいづれにおいてもO_2が蛋白の外側からヘム鉄に到達する道筋が存在しない。リガンドの脱着に伴う蛋白の速い構造変化をナノ秒のポンプ/プローブ時間分解ラマン分光法で追跡した。リガンドとして一酸化炭素を用いた。COはサブピコ秒で光解離し、100ナノ秒からミリ秒にかけて再結合する。再結合した分子のFe-CO伸縮振動を観察するシステムを組立て、まずヒトミオグロビンとその遠位ヒスチヂン変異体6種について上記の測定をした。続いてクジラミオグロビンの人工変異体についても数種測定し、静的なFe-CO伸縮振動数が〜490cm^<-1>のものの再結合が〜510cm^<-1>のものより相当速いことを見つけた。しかし再結合途中で、いわゆるオープン形に相当するバンドは観測されなかった。この結果の解釈のため、蛋白質の分子動力学計算をする一方で、非経験的分子軌道計算をも実施した。

研究成果

• [文献書誌] T.Kitagawa and Y.Mizutani: "Resonance Raman Spectra of Highly Oxidized Metalloporphyrins and Heme Proteins" Coordination Chemistry Reviews. 135. 685-735 (1994)
• [文献書誌] S.Nakashima and T.Kitagawa: "Recombination Intermediates of Photodissociated CO Myoglobins at Ambient Temperatures Detected by Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy" Journal of tha American Chemical Society. 116. 10318-10319 (1994)
• [文献書誌] D.A.Phoshlyadov,T.Ogura,K.Shinzawa-Itoh,S.Yoshikawa,E.H.Appelman,and T.Kitagawa: "Selective Resonance Enhancement of the “607nm" Form Generated in the Reaction of Oxidized Cytochrome c Oxidase with Hydrogen Peroxide" Journal of Biological Chemistry. 269. 29385-29388 (1994)
• [文献書誌] P.Jewsbury,S.Yamamoto,T.Minato,M.Saito,and T.Kitagawa: "The Proximal Residue Largely Determines the CO Orientation in Carbonmonoxy Globin Proteins.An ab intio Study of a Haem Prosthetic Unit" Journal of the American Chemical Society. 116. 11586-11587 (1994)
• [文献書誌] P.Jewsbury and T.Kitagawa: "The Distal Residue-CO Interaction in Carbonmonoxy Myoglobins:A Molecular Dynamics Study of Two Distal Histidine Tautomers" Biophysical Journals. 67. 2236-2250 (1994)
• [文献書誌] S.Hirota,T.Ogura,E.H.Appelman,K.Shinzawa-Itoh,S.Yoshikawa,and T.Kitagawa: "Observation of a New Oxygen-Isotope-Sensitive Raman Band for Oxy-Hemoproteins and Its Implications in Heme Pocket Structures" Journal of the American Chemical Society. 116. 10564-10572 (1994)