| 研究課題/領域番号 |
05454156
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
橘 正道 千葉大学, 医学部, 教授 (50009081)
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| 研究分担者 |
園田 智子 千葉大学, 医学部, 教務職員 (20143307)
石塚 俊治 千葉大学, 医学部, 助手 (50232294)
石嶌 純男 千葉大学, 医学部, 助手 (70184520)
鈴木 信夫 千葉大学, 医学部, 助教授 (90111426)
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| キーワード | ホスホリボシルピロリン酸合成酵素 / 核酸前駆体合成 / 結合タンパク質 / 活性制御タンパク質 / 融合タンパク質 / 分子接触部位 |
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| 研究概要 |
核酸前駆体、ヌクレオチド合成の重要な調節因子の一つはホスホリボシルピロリン酸(PRPP)の細胞内濃度である。本研究ではPRPP合成酵素触媒サブユニットに結合し、活性を制御していると考えられるタンパク質(39kDa)の構造と性質を解析し、以下の成果を得た。1. 39kDaタンパク質の遺伝子組換え法による作製と精製 本タンパク質の過剰により生じる細胞毒性を避けるため、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオン-Sepharoseを用いて精製した。 2. 39kDaタンパク質の触媒活性に対する効果の解析 触媒サブユニット(遺伝子組換え法で既に調製済み)に上記1で得た39kDaタンパク質融合体あるいはトリプシンにより消化したペプチドを加えて、活性を測定した。両者を単に混合したのみでは活性に変化はないが、1M MgCl_2処理により触媒サブユニットの多量体を解離させたのち再会合させると、39kDaタンパク質量依存的に触媒活性が抑制された。このことから本タンパク質の抑制作用が明確となった。 3. 両タンパク質の分子接触部位の解析 上記2で得たトリプシン消化産物をゲル濾過し、各フラクションを触媒サブユニットに作用させると、分子量一万以下のペプチド断片でも抑制効果があり、39kDaタンパク質の一次構造上比較的限られた領域が触媒サブユニットに結合し、活性を抑制していることが示唆された。しかし、逆相HPLCによりこのトリプシン消化産物をさらにペプチドレベルにまで精製すると、弱い抑制効果を示すペプチド断片しか得られない。したがって、十分な抑制効果を示すには複数のペプチド断片を必要とする可能性が高く、さらに解析を続行する計画である。
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