| 研究概要 |
アデニル酸キナーゼ(AK)は、生体が増殖、分化、運動、代謝などの機能を正常に発揮するために必要な細胞内アデニンヌクレオチドの恒常性維持に重要な役割を担う酵素であり、細菌から動物にいたるまで広く生物界に分布する。脊椎動物では3種のアイソザイム(AK1,AK2,AK3)が存在し、それぞれ組織分布、並びに細胞内局在性が異なる。本研究では、培養細胞系を用いて、3種のアイソザイムの内、1つまたは複数を欠く変異細胞を作製し、それらの表現系を調べることによりアデニル酸キナーゼアイソザイムの生理的意義を解明することを目的とした。
3種のAK遺伝子が存在し発現していることを確認したHeLa細胞を用いて相同的組換によるにアデニル酸キナーゼ遺伝子破壊のために、AK1遺伝子に対して2種類のターゲッティイングベクターを作製した(AK1-Bsr,AK1-Neo)。このベクターには、blasticidin S耐性遺伝子やneomycin耐性遺伝子などのポジティブ選択遺伝子とともに、相同的組換を高めるためのネガティブ選択としてジフテリア毒素Aサユニット遺伝子も組み込んだ。
また、HeLa細胞のAK2遺伝子を破壊するためには、ヒトのAK2染色体DNAが必要となる。ウシAK2の全長cDNAをプローブとしてスクリーニングを行い、HeLa細胞からヒトAK2cDNAを単離した。得られたcDNAをプローブとしてヒトゲノムDNAライブラリーをスクリーニングした結果、エクソン1を含む約9.5kbの染色体DNAを得た。これをもとにAK2遺伝子に対するターゲッティイングベクターを、前述と同様に作製することが可能となった。
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