顆粒球・単球系細胞特異的遺伝子および産物の構造と機能について

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05454183
• 研究機関: 大分医科大学
• 研究代表者: 山本 俊輔 大分医科大学, 医学部, 教授 (90040188)
• 研究分担者: 秋月 真一郎 大分医科大学, 医学部, 助手 (80159334)
• キーワード: MS2 / metalloproteinase / dismtegrin / CD14 / TNFα / transgene / recombinant

研究概要

MS2について:1.マウスMS2(mMS2)遺伝子発現機序の解析:mMS2のMφ細胞株における特異的発現およびリポポリサッカライド(LPS)による発現増強のシス領域をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)アッセイで検討し各々複数の領域の存在を確認した。1.mMS2およびヒトMS2(hMS2)の機能解析:(A).MS2リコンビナント蛋白(RP)の分離:大腸菌、昆虫細胞系ベクターを用いて各ドメイン蛋白のRPを合成分離した。(B).PA1蛋白の機能検索:RPの抗血小板凝集作用を凝集計で検索し、PA1活性の存在を証明した。この活性が抗MS2抗体で阻止されることを観察した。(C).単クローン抗体(mAb)作成:mMS2およびhMS2のRPに対するmAbを作成した。マウスおよびヒトの種々の血液細胞における発現を検討し、単球系細胞および好中球に特異的に発現することを確認した。CD14について:1.CT14遺伝子発現機序の解析:TPA responsive element様配列(TRE)のオリゴヌクレオチドを合成しこれをDNA結合ラテックスに結合させHINS-B3細胞の核蛋白をこのカラムでaffinity精製した。このカラムによりTREと結合する三種のDNA結合蛋白を観察した。2.Kupffer細胞(KC)におけるCD14の意義の検索:KCとはMφのCD14,CD18,TNFα,IL-1,IL-6のmRNA発現を検討し、KCにおけるCD14はLPSのスカベンジャーとしても機能することを明らかにした。3.LPSのシグナル伝達におけるCD14の意義:リピドAのアナログリピドIV_AとRhodobacter spheroides Iipid A (RSLA)のLPSとCD14移入細胞を用いた実験からCD14がLPSとCD14関連性のLPSシグナル伝達因子との結合を助長することによりLPSへの感受性を促進させることを示唆する成績を得た。4.CD14の活性部位検索:mCD14のN末端から109個のペプチドを大腸菌にsoluble formとして発現しHPLCで精製することに成功した。5.マウス腹腔MφのLPS刺激によるTNFα遊離機序解析:ヒト末梢血単球のLPS刺激にCD14が関与するが、マウス腹腔MφではLPS刺激によるTNFα産生は抗mCD14抗体で阻止されないことが判明した。一方、マウスMφ細胞株J774細胞のそれは阻止されることを確認した6.CD14トランスジェニックマウス(TM)樹立と解析:メタロチオネイン遺伝子5'領域をプロモーターとする天然型(模型)とC末端短縮型(非膜型)のCD14を発現するTMの作成に成功した。両型とも通常食では肝に発現し、50mM/ml亜鉛投与TMでは両型とも小腸に強く発現した。非膜型TMでは末梢血遊離mCD14値が正常および膜型TMのそれに比べ有意に高く、また、LPS投与時のTNFαの値も有意に高いことを観察した。

研究成果

• [文献書誌] Matsuura,K.: "Upregulation of mouse CD14 expression in Kupffer cells by lipopolysaccharide" Journal of Experimental Medicine. 179. 1671-1676 (1994)
• [文献書誌] Hijiya,N.: "Cloning and characterization of the human osteopontin gene and its promoter" Biochemical Journal. 303. 255-262 (1994)
• [文献書誌] Ishida,T.: "Enhancement of murine serum amyloid A3 (SAA3) mRNA expression by glucocorticoids and its regulation by cytokines" Journal of Leukocyte Biology. 56. 797-806 (1994)
• [文献書誌] Nishijima,M.: "Identification of a biochemical lesion,and characteristic response to lipopolysaccharide (LPS) of a cultured macrophage-like cell mutant with defective LPS-binding" Journal of Biochemistry. 116. 1082-1087 (1994)
• [文献書誌] Saitoh,Y.: "Expression of osteopontin in human glyoma : its corrlelation with the malignancy" Laboratory Investigation. 72. 55-63 (1995)
• [文献書誌] Takatsuka,N.: "Suppression of TNF-α mRNA expression in LPS-primed macrophages occurs at the level of NF-kB activation,but not CD14 expression" Journal of Immunology. (in press).
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Structure of the osteopontin gene and promoter" Annals of New York Academy of Science. in press
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Effect of recombinant osteopontin on adhesion and migration of P388D1 cells" Annals of New York Academy of Science. in press
• [文献書誌] Miyazaki,Y.: "Osteopontin : Role in cell signalling and adhesion" Annals of New York Academy of Science. in press
• [文献書誌] Nasu,K.: "Expression of wild type and mutated rabbit osteopontin in Escherichia coli,and their effects on adhesion and migration of P388D1 cells" Biochemical Journal. in press
• [文献書誌] 樋口安典: "CD14とエンドトキシンショック" 臨床免疫. 印刷中
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Leukocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens" Springer Verlag (in press), (1995)
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Leukocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens" Springer Verlag (in press), (1995)
• [文献書誌] 樋口安典: "現代病理学大系" 中山書店, 印刷中 (1995)
• [文献書誌] Delude,R.L.: "Bacterial Endotoxin Vol.111 : Recognition and Effector Mechanisms" Elsevier Science Pblisher, in press