細菌感染時の白血球によるスーパーオキシド産生系活性化の機構とその異常に関する解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05454189
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 金ヶ崎 士郎 東京大学, 医科学研究所, 教授 (10012767)
• 研究分担者: 小林 園子 東京大学, 医科学研究所, 教務職員 (00013764) ; 布井 博幸 東京大学, 医科学研究所, 助手 (50218260) ; 大海 忍 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (20160046)
• キーワード: 好中球 / スーパーオキシド / b型シトクロム / 47kDa蛋白質 / 慢性肉芽腫症

研究概要

好中球のスーパーオキシド産生系には形質膜上の特殊なb型シトクロムと細胞質の複数の蛋白質が関与する。これらの蛋白質は刺激により膜上に会合して、活性化されたスーパーオキシド産生系が形成される。我々は細胞質側に長く伸長しているシトクロム大小2個のサブユニットのカルボキシル(C)末端のアミノ酸配列相当するペプチドを合成し、膜と細胞質からなる無細胞スーパーオキシド産生系に対する競合試験を行った。そしてこれらのペプチドがスーパーオキシドの産生を濃度依存的に阻害することを明らかにした。この阻害はシトクロムのC末端部分に結合すべき細胞質の蛋白質が加えたC末端部分の配列のペプチドと反応するために引き起こされたものと推定された。そこで還元状態では切断可能な架橋剤を用いてこれらのペプチドが結合している相手を同定したところ、細胞質の47kDaの蛋白質が相手であることが判明した。さらに、電気穿孔法により好中球細胞内に、シトクロム大鎖のC末端配列ペプチドに光感受性架橋剤を結合したものを導入した。そしてこの細胞を走化性因子で刺激後、紫外線で架橋しペプチドの結合相手を同定した。この場合もやはり相手は細胞質の47kDaの蛋白質であることが判明した。これらのことは系の活性化に際し、47kDaの蛋白質とシトクロムのC末端部分の結合が重要な鍵であることを示している。またシトクロム小鎖のヘム結合部位と考えられるHis-94近傍に相当する合成ペプチドが、無細胞系でのスーパーオキシド産生を阻害することを見い出した。このほか活性化の異常に関しては、シトクロムの点変異をもつ慢性肉芽腫症の患者や47kDa蛋白質に欠損のある患者の遺伝子解析を行って、変異部位を明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Iwata,M,H.Nunoi,T.Nakano,H.Niwa,S.Tsuruta,S.Ohga,H.Yamazaki,S.Ohmi,S.Kanegasaki and I.Matsuda: "Homologous dinucleotide(GT)deletion in Japanese patients with chronic granulomatous disease with p47-phox deficeincy." Biochim.Biophys.Res.Commun.199. 1372-1377 (1994)
• [文献書誌] Ono,Y.,O.Kunii,H.Suzuki,H.Ikeda,K.Kobayashi and S.Kanegasaki: "Opsonic activity of sera and blister fluid from severely burned patients evaluated by a chemiluminescence method." Microbiol.Immunol.38. 373-377 (1994)
• [文献書誌] Kanegasaki,S.,S.Imajoh-Ohmi,S.Nakanishi,R.Makino and Y.Ishimura: "Superoxide-generating system in phagocytes and B lymphocytes:Site of generation and activation mechanism." Frontiers of Reactive Oxygen Species in Biology and Medicine. 13-16 (1994)
• [文献書誌] Kikuchi,H.,T.Fujinawa,F.Kunbayashi,A.Nakanishi,S.Imjoh-Ohmi,M.Goto and S.Kanegasaki: "Induction of essential components of the superoxide gnerating system in human monoblastic leukemia U937 cells." J.Biocliem.116. 742-746 (1994)
• [文献書誌] Park,M-Y.,S.Imajoh-Ohmi,H.Nunoi and S.Kanegasaki: "Peptides corresponding to the region adjacent to His-94 in the small subunit of cytochrome b558 inhibit superoxide generation in a cell-free system from human neutrophils." Biochem.Biophys.Res.Commun.204. 924-929 (1994)