| 研究課題/領域番号 |
05454386
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中埜 粛 大阪大学, 医学部, 講師 (70028653)
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| 研究分担者 |
松若 良介 大阪大学, 医学部, 助手 (00243238)
澤 芳樹 大阪大学, 医学部, 助手 (00243220)
宮本 裕治 大阪大学, 医学部, 助手 (80229898)
中田 精三 大阪大学, 医学部, 助手 (50116068)
白倉 良太 大阪大学, 医学部, 教授 (00116047)
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| キーワード | Reperfusion / Neutrophil / Cytokine / Myocyte / Endothelial cell / Adhesion / Migration / Free Radical |
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| 研究概要 |
1.in vitro心筋モデルの開発
3-4週齢のラット心を摘出し、ランゲンドルフ潅流装置を用いて、collagenaseを逆行性に潅流し心筋細胞及び冠微小血管内皮細胞を単離し、percollを用いた分離分画法によりそれぞれを分離する方法を開発した。血管内皮細胞は2代目まで継代培養されたものをcollagen膜上に培養し下層には単離後24時間以内の心筋細胞を培養するin vitro心筋モデルを作成し、好中球の接着浸潤を中心とした心筋虚血再潅流傷害の機序を検討した。特に好中球の接着浸潤率の検討には、非特異的細胞表面染色蛍光色素であるPKH2を用いて、蛍光分光高度計による定量化する方法を開発確立した。
2.in vitro心筋虚血再潅流傷害
in vitro心筋モデルを機密式ボックス内にいれ、palladium catalystに水を加え、酸素を消費し、水素と二酸化炭素を発生させ、低酸素状態を作成した。この時のpO2は8-10mmHgであった。またhypoxiaの時間と心筋細胞障害の程度を検討したところ、超微細構造において、2時間までが不可逆的変化を示し、3時間以上では50%以上の細胞が不可逆的変化を示した。ボックスより心筋細胞を取り出し、再酸素化を行い、心筋虚血再潅流傷害モデルを作成した。この障害程度の評価法として、生物微弱発光検出器を用い、ATP、chemiluminescence及びtrypan blue染色による細胞可逆的変化の測定を行った。2時間のhypoxia及び再酸素化により心筋モデルはATP、chemiluminescence及びtrypan blue染色において有意に傷害されたが、さらに好中球を添加することにより傷害は有意に増悪した。
以上、本年度は基本的には、細胞分離法の確立、モデルの開発及び心筋再潅流傷害の再現とその傷害程度の評価法の確立を中心に研究を行った。次年度において、これらのモデルを用いて、機序に関与する種々のfactorの解明に取り組む予定である。
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