| 研究課題/領域番号 |
05454571
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物系薬学
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
池沢 宏郎 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (40080163)
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| 研究分担者 |
小林 とも子 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (70214533)
塚本 喜久雄 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (20183478)
田口 良 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (20080210)
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| 研究期間 (年度) |
1993 – 1995
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| キーワード | ホスホリパーゼB / スフィンゴミエリナーゼ / PI特異的ホスホリパーゼC / Penicillium notatum / Bacillus cereus / Bacillus thuringiensis / 酵素蛋白質一次構造 / 酵素活性部位 |
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| 研究概要 |
1.Bacillus cereusのスフィンゴミエリナーゼの一次構造と活性の相関の解析。部位特異的変異によりアミノ酸を1個だけ別のアミノ酸に置換する手法で、このホスホリパーゼの一次構造のうち、4アスパラギン酸残基をグリシンに、2ヒスチジン残基をアラニンにそれぞれ変換した6箇の変異体酵素をつくり、それぞれの酵素活性と溶血活性を測定した。本酵素と牛膵デオキシリボヌクレアーゼIとの構造上の相同性が判明したので、比較参照して解析した結果、151位,296位のヒスチジン、295位のアスパラギン酸は酵素の触媒活性および溶血活性に必須で、233位のアスパラギン酸は296位ヒスチジンと水素結合して酵素活性に影響を与え、126位および156位のアスパラギン酸は基質の認識に関与していることが明らかとなった。
2.真菌Penicillium notatumのホスホリパーゼBのGPIアンカー蛋白質としての構造特異性および遺伝子の発現。本酵素の遺伝子を大腸菌にトランスフェクトして、不活性型の蛋白質として発現させることに成功した。一方、本酵素がC末端に疎水性ペプチド領域を持ち、分子内にイノシトールを含むGPIアンカー蛋白質であることを見出し、かつ本酵素が菌のプロトプラストの膜表面から自己触媒的分解により遊離されてくることを証明した。
3.Bacillus thuringiensisのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)の大量生産系の構築。Bacillus brevisのホストーベクター系を用い、本酵素の遺伝子を発現させて、大量に酵素を産生させ、構造-活性相関の研究を行うのに充分な素地をつくった。収量はもとのB thuringiensisの培養に比べ、薬500倍となった。
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